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測序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫出了問題？！

——從測序數(shù)據(jù)看文庫構建

高通量測序中的文庫構建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測序平臺要求的過程，在高通量測序過程中，文庫質量直接影響終測序數(shù)據(jù)的質量，打個比方，如果文庫上機測序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴增所形成的DNA樣本簇就會很少，測序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導致測序失敗，所以我們說文庫的質量控制和質量評估也是NGS中的關鍵步驟。

文庫如何質控？

評估文庫質量的方法有哪些？

n 文庫質控：文庫在上機之前都有會進行質量檢測，質量檢測合格的文庫才會上機測序。文庫上機之前的文庫質控主要包括文庫片段大小和文庫濃度的質控，具體質控標準和實驗設計見往期推送：文庫質檢方案的合理設計--文庫分布、文庫濃度、文庫質量（超鏈接：h/t/t/ps://mp.weixin.qq.c/o/m/s/iM5eMweP1By6MoqrxOEBfw）。

n 文庫評估：文庫評估方法除了文庫大小和濃度之外，還包括文庫轉化率、文庫復雜度、均一性、準確性和覆蓋度等。

1）文庫轉化率：是評估文庫質量的重要指標，它指的是文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值，也代表測得產(chǎn)量與理論高產(chǎn)量之間的比值，這里的理論高產(chǎn)量考慮了PCR的擴增效率問題及純化產(chǎn)生的損失。計算方法如下：

理論高產(chǎn)量=輸入量×（1+PCR擴增效率）^{（PCR循環(huán)數(shù)）}×（純化回收率）^{（clean up數(shù)）}

為什么說文庫轉化率是重要指標呢？這是因為只有雙端都連接上接頭的目的片段才能在FlowCell上面通過橋式擴增形成簇，終完成測序過程，而不是雙端都連上接頭的目的片段終都不能完成測序過程，視為無效片段，如果這樣的片段過多直接影響終輸出數(shù)據(jù)的過少，甚至可能直接導致測序的失敗。

圖1.雙端帶接頭的DNA片段在Flowcell上擴增圖

2）文庫復雜度：指的是文庫中DNA序列的復雜程度，一定的文庫復雜度對后期測序數(shù)據(jù)的分析尤為重要，復雜度高的文庫測序得到的數(shù)據(jù)重復讀數(shù)少，可以帶來更多有意義的信息，反之，低復雜度的文庫在信號讀取時往往產(chǎn)生簇信號混雜，易產(chǎn)生低質量的測序數(shù)據(jù)。

文庫復雜度與Input樣本質量、文庫的轉化率、文庫擴增時循環(huán)數(shù)有關。當文庫的轉化率越高時，能從樣品種捕獲更多的特異分子，文庫復雜度就越高；當輸入樣本量越低或文庫擴增循環(huán)數(shù)越多時，文庫中不能帶來有意義信息的重復讀數(shù)就會增多，則文庫的復雜度越低。

表1.測序數(shù)據(jù)關鍵參數(shù)比較

3）均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖2所示，一般認為覆蓋越均勻，達到特定深度所需的測序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在文庫制備和文庫擴增步驟中引入的，也就是說，覆蓋均一性很多時候取決于GC含量。

圖2.測序數(shù)據(jù)均一性

4）準確性：

NGS文庫制備的準確性越高，你對變異報告的信任程度就越高。核苷酸錯誤通常在PCR擴增以及測序過程中引入。測序錯誤通常低于1%。通過使用高保真PCR試劑，可盡量減少文庫擴增的錯誤。NGS對照樣品也有助于評估NGS流程的準確性。 

圖3.PCR擴增存在一定的錯配率

5）測序深度和覆蓋度：

假設對長1000 bp的目標區(qū)域進行捕獲測序，每個read長10 bp，總共得到3000個reads，把所有的reads對比到目標區(qū)域后，1000 bp的目標區(qū)域中有990 bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的10bp沒有1個read覆蓋。

則此時：

測序深度（depth）3000*10/1000=30 也就是說測序深度為30*

覆蓋度（coverage）990/1000*100%=99% 這次測序覆蓋度為99%

同理：

假設對長100bp的目標區(qū)域進行捕獲測序，每個read長5bp，總共得到200個reads，把所有的reads對比到目標區(qū)域后，100bp的目標區(qū)域中有98bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的2bp沒有1個read覆蓋。

深度（depth）200*5/1000=10 也就是說測序深度為 10*

覆蓋度（coverage）98/100*100%=98% 這次測序覆蓋度為98%

文庫構建中的哪些步驟會直接影響測序質量？

NGS的終目的就是得到測序數(shù)據(jù)助力于下游科學研究或實際應用，其中文庫構建是測序數(shù)據(jù)的重要影響因素，文庫構建一般包括以下幾類步驟（以DNA為例）：樣本片段化、接頭連接、分選/純化、文庫擴增。文庫對測序數(shù)據(jù)的影響，具體到文庫構建的每個步驟，參考表2。

表2.建庫步驟對測序結果的影響