亞“G1”峰檢測法檢測細(xì)胞凋亡
處于增殖周期中的細(xì)胞,根據(jù)其所處不同周期時相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段,在酒精固定后,用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜,使細(xì)胞原有的DNA部分丟失,僅剩下大片段DNA,這些細(xì)胞在DNA染色后,用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測其DNA含量,會出現(xiàn)一個DNA含量<2n(即<G1期細(xì)胞的分布區(qū),稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。 【樣品來源】 (1)懸浮生長的培養(yǎng)細(xì)胞; (2)貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞懸液; (3)離體細(xì)胞懸液。 將樣品分組,即空白對照組(未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)和實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)。 【材料與試劑】 (1)PBS緩沖液; (2)70%酒精; (3)DNA抽提緩沖液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合,調(diào)整pH到7.8; (4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。 【操作步驟】 (1)1~5×106 個細(xì)胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上; (2)洗滌:離心,棄去酒精,細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中,再離心,棄去上清; (3)DNA片段抽提:將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提緩沖液,混勻,室溫下靜置5min,離心,棄去上清; (4)DNA染色:將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液,室溫下避光染色30min; (5)流式細(xì)胞儀測定:選用波長488nm 藍(lán)色激發(fā)光,同時測定紅色熒光和前向角散射光;每例樣品測定5000~10000個細(xì)胞。 注:所有離心步驟均為1000r/min,5min。 【結(jié)果分析】 實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)的 DNA 組方圖上,在G1峰前出現(xiàn)一個呈高斯分布的峰(亞“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比;空白對照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰,或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生,但其百分比不超過5%;發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰,但可出現(xiàn)一個連續(xù)的DNA小片段分布曲線,以此可與凋亡區(qū)分開來。 |
處于增殖周期中的細(xì)胞,根據(jù)其所處不同周期時相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段,在酒精固定后,用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜,使細(xì)胞原有的DNA部分丟失,僅剩下大片段DNA,這些細(xì)胞在DNA染色后,用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測其DNA含量,會出現(xiàn)一個DNA含量<2n(即<G1期細(xì)胞的分布區(qū),稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。 【樣品來源】 (1)懸浮生長的培養(yǎng)細(xì)胞; (2)貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞懸液; (3)離體細(xì)胞懸液。 將樣品分組,即空白對照組(未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)和實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)。 【材料與試劑】 (1)PBS緩沖液; (2)70%酒精; (3)DNA抽提緩沖液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合,調(diào)整pH到7.8; (4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。 【操作步驟】 (1)1~5×106 個細(xì)胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上; (2)洗滌:離心,棄去酒精,細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中,再離心,棄去上清; (3)DNA片段抽提:將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提緩沖液,混勻,室溫下靜置5min,離心,棄去上清; (4)DNA染色:將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液,室溫下避光染色30min; (5)流式細(xì)胞儀測定:選用波長488nm 藍(lán)色激發(fā)光,同時測定紅色熒光和前向角散射光;每例樣品測定5000~10000個細(xì)胞。 注:所有離心步驟均為1000r/min,5min。 【結(jié)果分析】 實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)的 DNA 組方圖上,在G1峰前出現(xiàn)一個呈高斯分布的峰(亞“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比;空白對照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰,或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生,但其百分比不超過5%;發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰,但可出現(xiàn)一個連續(xù)的DNA小片段分布曲線,以此可與凋亡區(qū)分開來。 |
處于增殖周期中的細(xì)胞,根據(jù)其所處不同周期時相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段,在酒精固定后,用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜,使細(xì)胞原有的DNA部分丟失,僅剩下大片段DNA,這些細(xì)胞在DNA染色后,用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測其DNA含量,會出現(xiàn)一個DNA含量<2n(即<G1期細(xì)胞的分布區(qū),稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。
【樣品來源】
(1)懸浮生長的培養(yǎng)細(xì)胞;
(2)貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞懸液;
(3)離體細(xì)胞懸液。
將樣品分組,即空白對照組(未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)和實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)。
【材料與試劑】
(1)PBS緩沖液;
(2)70%酒精;
(3)DNA抽提緩沖液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合,調(diào)整pH到7.8;
(4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。
【操作步驟】
(1)1~5×106 個細(xì)胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上;
(2)洗滌:離心,棄去酒精,細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中,再離心,棄去上清;
(3)DNA片段抽提:將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提緩沖液,混勻,室溫下靜置5min,離心,棄去上清;
(4)DNA染色:將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液,室溫下避光染色30min;
(5)流式細(xì)胞儀測定:選用波長488nm 藍(lán)色激發(fā)光,同時測定紅色熒光和前向角散射光;每例樣品測定5000~10000個細(xì)胞。
注:所有離心步驟均為1000r/min,5min。
【結(jié)果分析】
實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組)的 DNA 組方圖上,在G1峰前出現(xiàn)一個呈高斯分布的峰(亞“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比;空白對照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰,或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生,但其百分比不超過5%;發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰,但可出現(xiàn)一個連續(xù)的DNA小片段分布曲線,以此可與凋亡區(qū)分開來。
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