福爾馬林固定后石蠟包埋的組織簡(jiǎn)稱為FFPE樣品。

將組織在 4–10% 的福爾馬林中迅速固定。 固定時(shí)間限制在 14–24 小時(shí) (越長(zhǎng)的固定時(shí)間將越容易導(dǎo)致DNA的片段化，對(duì)下游實(shí)驗(yàn)不利)。將固定組織*脫水 (*脫去福爾馬林殘余，因?yàn)槠渥璧K蛋白酶K的作用)。
純化DNA時(shí)，使用新鮮從石蠟塊上切下的組織，每次制備最大量：. 每片10 μm. 最多 8 片, 每片大約 250 mm2, 如果對(duì)樣品總量和產(chǎn)量沒(méi)有把握，建議用2-3 片樣品進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)。

QIAamp DNA FFPE Tissue FFPE組織樣品DNA操作流程

■ 去除石蠟：融解于二甲苯并去除

■ 裂解：在變性條件下和 proteinase K 孵育

■ 加熱90°C ：逆轉(zhuǎn)交聯(lián)

■ 結(jié)合上柱：合適的溶液環(huán)境下，DNA 結(jié)合上硅膠膜柱

■ 洗滌： 洗滌殘留污染物

■ 洗脫：純化并濃縮的DNA

試劑盒中溶液配方和含量New Elution Buffer ATE (調(diào)節(jié)到較高的pH, 與PCR 酶的通適性更強(qiáng)）

FFPE樣品 RNA 和 miRNA 純化原理簡(jiǎn)述：

經(jīng)福爾馬林固定的組織會(huì)引起RNA-RNA和RNA-蛋白交聯(lián)，這些會(huì)影響RNA在下游應(yīng)用中的表現(xiàn)。miRNeasy FFPE Kit提供*的裂解液和孵育條件，逆轉(zhuǎn)福爾馬林對(duì)DNA造成的修飾。由此可確保抽提所得RNA在包括real-time RT-PCR等一系列下游應(yīng)用中*的表現(xiàn)。*的裂解緩沖夜可將RNA從組織切片中有效釋放出來(lái)，同時(shí)避免RNA進(jìn)一步的講解。該試劑盒也應(yīng)用gDNA 去除柱有效去除基因組。經(jīng)優(yōu)化的結(jié)合條件可確保純化大約18 nt以上的RNA。RNA產(chǎn)量和表現(xiàn)都優(yōu)于 其他miRNA純化方法，如苯酚-氯仿抽提法。

操作過(guò)程：

整個(gè)miRNeasy FFPE過(guò)程可在70分鐘內(nèi)完成。經(jīng)優(yōu)化的裂解緩沖夜可確保在15分鐘內(nèi)應(yīng)用蛋白酶 K 裂解樣本，不影響RNA產(chǎn)量。裂解之后，在80oC條件下孵育樣本15分鐘，逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)。然后應(yīng)用gDNA去除柱快速去除基因組 DNA，應(yīng)用 RNeasy MinElute spin columns純化濃縮的RNA。由于RNA僅洗脫至14-30 µl，下游應(yīng)用中的反應(yīng)體積可更小 。

各種文獻(xiàn)對(duì)于RNA純化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

1、獲得樣品后，盡快開(kāi)始固定。

2、將樣本切薄再浸泡 (如果能到 5mm 或更薄最好)。

3、避免過(guò)度固定，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

4、RNA 純化要包括逆轉(zhuǎn)膠聯(lián)的步驟。QIAGEN的試劑盒中的步驟正滿足這樣的建議。

5、純化的樣品最好是固定或者包埋時(shí)間在半年內(nèi)的樣本。放置時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)于RNA純化越不利。

在后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用隨機(jī)引物或者混合物而不是僅僅使用oligo-dT。設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄PCR時(shí)，注意擴(kuò)增子的片段長(zhǎng)度不要過(guò)長(zhǎng)。

Figure 1. Recovery of small RNA fragments from FFPE tissues. Agilent bioanalyzer analysis was carried out on RNA purifed from
RNAlater stabilized tissues (RNAlater), FFPE tissues stored for 1 year (FFPE 1 year), or FFPE tissues stored for 1 week (FFPE 1 week).

RNA was successfully purified from both the 1-week-old and 1-year-old FFPE tissues, including partially degraded small RNA fragments (Figure 1). Significant degradation of RNA in the FFPE tissues occurred after 1 year of storage, as demonstrated by the reduced size of the RNA and disappearance of the rRNA double peaks in the Agilent bioanalyzer traces. RNA purified from all tissues yielded A260/A280 ratios* of around 2.0, an indication of high purity.

RNA preparation: RNA was purified from the tissue samples after 1 week or 1 year of storage. For the FFPE tissues, RNA was purified from 1–4 sections of 10 μm thickness using the RNeasy FFPE Kit.

Sections were cut on a standard microtome and the first 2 sections were discarded to exclude the effects of air exposure. For the RNAlater stabilized tissues, RNA was purified using the RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. RNA was quantitated by measuring absorbance at 260 nm on a NanoDrop® spectrophotometer. RNA quality was assessed on an Agilent® bioanalyzer in “Eukaryotic Total RNA