固體和半固體樣品：

稱(chēng)取25g樣品，置于225mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打lmin～2min制成1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯中,8000r/min～10000r/min均質(zhì)lmin～2min制成1:10的樣品勻液。

液體樣品：

應(yīng)先將其充分搖勻后,以無(wú)菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中,充分振搖﹐制成1:10的樣品勻液。

樣品稀釋：

用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取l:10樣品勻液lmL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無(wú)菌試管中。

另取1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次lml滅菌吸管或吸頭。

培養(yǎng)：

根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì),選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度﹐每個(gè)稀釋度水浴80℃±l℃維持10min,吸取菌液0.2 mL接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板內(nèi),使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面,涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后,將平板靜置10min使接種物*被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。

菌落計(jì)數(shù)：

選取特征菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于20CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于200CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。

當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(zhǎng)時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

菌落挑選和純培養(yǎng)：

挑選平板上5個(gè)白色不透明、濕潤(rùn)、邊緣光滑的菌落分別轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。

形態(tài)學(xué)鑒定：

革蘭氏染色,鏡檢。地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,呈桿狀,長(zhǎng)度1.5u.m～3.5um,單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列,有芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大。

生化鑒定：

使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。