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HPL人胎盤泌乳素ELISA試劑盒
美國DRG*，貨號(hào)：EIA1283
美國DRG中國*代理商“深圳科潤達(dá)生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)
1、 前言說明
DRG公司的HPL（人胎盤泌乳素）ELISA試劑盒可用于人血清中HPL的定量檢測。此試劑盒僅供體外診斷用。
HPL的是生理學(xué)功能到目前為止還未確定，但它很大程度上與人生長激素一樣是孕期胎兒胎盤和生理變化的調(diào)節(jié)者，這表明母體血清HPL的水平可以放映胎盤的功能。
在（胎兒）宮內(nèi)死亡、嬰兒分娩疼痛和生產(chǎn)時(shí)胎兒窒息的病例中，其人胎盤泌乳素（HPL）水平會(huì)降低。如果HPL的低水平重復(fù)出現(xiàn)，那么這種相關(guān)性就特別明顯，它表明子宮長期處于這種狀態(tài)就會(huì)使胎兒受到損害。如果孕期正常，母體HPL水平降低（的情況）一般不會(huì)出現(xiàn)。在單胎妊娠中，如果HPL水平升高則意味著*的妊娠結(jié)果。然而高水平的HPL也有可能意味著嬰兒潛在某些特定疾病，如糖尿病嬰兒先天肥胖性巨體、新生兒溶血癥和胎兒水腫病的重要病理學(xué)原因。
2、實(shí)驗(yàn)原理
DRG公司的HPL酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合HPL分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性HPL的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗HPL抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。辣根過氧化物酶的結(jié)合總量與樣本中HPL的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強(qiáng)度與病人樣品中HPL的濃度成正比。
3、試劑
1） 微孔反應(yīng)板，可拆，12×8（96孔），包被有抗HPL的單克隆抗體。
2） 標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品1-4），4支，0.5ml，待用。濃度：1.25；5.0；10.0；20mg/L，轉(zhuǎn)換系數(shù)：1mg/L=1mIU/L。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
3） 零標(biāo)準(zhǔn)品（也用做樣品稀釋液），1支，90ml，待用，0mg/L。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
4） 酶聯(lián)物，1支，11ml，聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗HPL 抗體。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。
5） 底物溶液，1支，11ml，待用，TMB（四甲基聯(lián)苯胺）
6） 終止液，1支，6ml ，內(nèi)含0.5M的H2SO4。請(qǐng)不要接觸終止液，以免刺激皮膚和著燒。
4、貯存條件
未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑。酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。
微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。拆開包裝后，包被的微孔反應(yīng)板的免疫活性可在約6周內(nèi)保持穩(wěn)定，但必須密封在裝有干燥劑的袋子里。
5、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標(biāo)儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標(biāo)儀）
2） 配有一次性使用的10μl、50μl、100μl和1000μl吸嘴的取樣槍
3） 吸水紙。
4） 蒸餾水
5） 用于樣品稀釋的試管（12×75mm）。
6、樣品
血清將會(huì)在此實(shí)驗(yàn)中用到。不要使用易溶血、黃疸血或脂血樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不可用于此實(shí)驗(yàn)。
1） 樣品的采集：血清，靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機(jī)分離血清。未*凝血前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時(shí)間。
2） 樣品的儲(chǔ)存：必須蓋住樣本并在實(shí)驗(yàn)之前于２-８℃下可貯存至５天。樣品需要更長的貯存時(shí)間，必須在實(shí)驗(yàn)之前于-20℃下一次性凍存。融化的樣本在檢測之前必須要上下倒置幾次。
3） 樣品的稀釋：實(shí)驗(yàn)開始前，用零標(biāo)準(zhǔn)品按1：100的比例稀釋樣品。首先在每一樣品試管中加入1ml零標(biāo)準(zhǔn)品，再向相應(yīng)的試管中加入10μL樣品，把所有的試管在旋渦混合器上混合10秒（避免氣泡）
4） 在實(shí)驗(yàn)中，樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用零標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。
7、一般注意事項(xiàng)
1） 所有試劑和樣本在使用之前必須平衡至室溫。所有試劑必須搖勻但不能起泡沫。
2） 一旦檢測開始，所有的操作步驟必須進(jìn)行到底不能中斷。
3） 為了避免交叉放映，每一標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品的取樣都必須使用新的取樣吸頭。
4） 吸光度值是由孵育的時(shí)間和溫度所決定的。在實(shí)驗(yàn)開始之前，建議準(zhǔn)備好所有的藥劑旋開蓋子。
將所需檢測的微孔板條固定在板架上等。這些準(zhǔn)備工作將確保每次的加液步驟所需時(shí)間相同，沒有中斷。
5） 按一般的規(guī)律，酶免反應(yīng)的強(qiáng)度與時(shí)間和溫度成線性比例。
8、實(shí)驗(yàn)步驟
8.1操作注意事項(xiàng)
1） 手工加樣：建議每次實(shí)驗(yàn)做不超過32個(gè)檢測孔?；蛘?，建議在三分鐘內(nèi)加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品。
2） 自動(dòng)加樣：每次實(shí)驗(yàn)可做整板96個(gè)檢測孔?；蛘?，建議在三分鐘內(nèi)加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品。
3） 所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都必須同時(shí)做雙份，以保證所有的檢測條件都一樣。每次檢測都必須有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.2具體的實(shí)驗(yàn)步驟
1） 將所需數(shù)量的板條固定到板架上。
2） 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取10μL加入到相應(yīng)的微孔中。
3） 在每一微孔中加入100μL酶聯(lián)物。
4） 充分混勻10秒，在這個(gè)步驟*混勻很重要。
5） 室溫孵育30分種。
6） 快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL蒸餾水洗板5次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和度。
7） 在每一微孔中加入100μl底物。
8） 室溫孵育10分種。
9） 加50μl終止液到每個(gè)檢測孔中終止酶反應(yīng)。
10） 加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測定OD 值。
9、結(jié)果計(jì)算
1） 計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。
2） 用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3） 用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。
4） 自動(dòng)計(jì)算方法：IFU上的結(jié)果是用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算得到的。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。
5） 樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。
10、期望值
強(qiáng)烈建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都建立自己實(shí)驗(yàn)室的正常和不正常值。在一次研究中，我們用DRG公司的hPL ELISA進(jìn)行檢測，得到如下結(jié)果：
| 孕周 | 數(shù)值（mg/L） |
| 10-12 | 0.05-1.00 |
| 12-14 | 0.10-1.7 |
| 14-16 | 0.3-2.8 |
| 16-18 | 0.5-3.5 |
| 18-20 | 0.9-4.0 |
| 20-22 | 1.1-5.0 |
| 22-24 | 1.3-5.8 |
| 24-26 | 1.6-6.7 |
| 26-28 | 2.0-7.7 |
| 28-30 | 2.7-8.5 |
| 30-32 | 3.2-9.5 |
| 32-34 | 3.7-10.1 |
| 34-36 | 4.0-10.7 |
| 36-38 | 4.3-11.2 |
| 38-40 | 4.4-11.7 |
| 40-42 | 4.3-11.6 |
產(chǎn)品性能特點(diǎn)
１． 特異性
用來檢測的抗原 與HPL等價(jià)
人絨毛膜促性腺激素 2000IU/ L 檢測不出
催乳激素 200μg/L 檢測不出
甲胎蛋白 300KIU/L 檢測不出
人生長激素 100μg/L 檢測不出
２． 靈敏度
用本實(shí)驗(yàn)方法測得的HPLzui小濃度值為0.043 mg/L。
３． 度
a. 批內(nèi)差實(shí)驗(yàn)度
該度是由在一實(shí)驗(yàn)當(dāng)中對(duì)3個(gè)不同質(zhì)控品的重復(fù)測定來決定的。批內(nèi)差異羅列如下：
| 血清樣本 | 1 | 2 | 3 |
| 重復(fù)次數(shù) | 18 | 18 | 18 |
| HPL平均值（mg/L） | 0.66 | 2.34 | 6.24 |
| 標(biāo)準(zhǔn)差 | 0.04 | 0.13 | 0.42 |
| 差異系數(shù)（%） | 6.06 | 5.55 | 6.73 |
b. 批間差實(shí)驗(yàn)度
該度是由在幾次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中對(duì)3個(gè)不同質(zhì)控品的重復(fù)測定來決定的。批間差異羅列如下：
| 血清樣本 | 1 | 2 | 3 |
| 重復(fù)次數(shù) | 39 | 24 | 24 |
| HPL平均值（mg/L） | 0.68 | 2.52 | 6.87 |
| 標(biāo)準(zhǔn)差 | 0.06 | 0.18 | 0.39 |
| 差異系數(shù)（%） | 8.82 | 7.14 | 5.67 |
４． 重復(fù)性和線性
a. 重復(fù)性
不同的已知HPL水平的病人血清樣本混合起來并做雙份實(shí)驗(yàn)。平均重復(fù)率為101.17%。
期待濃度值（mg/L） 測得的濃度值（mg/L） 重復(fù)率（%）
| |
b. 線性
在線性研究中，用零標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)兩個(gè)病人樣本進(jìn)行一系列的稀釋。平均重復(fù)率為99.7%。
病人樣本號(hào) 稀釋度 期待濃度值（mg/L） 測得的濃度值（mg/L） 重復(fù)率（%）
| |
５． Hook’s效應(yīng)
本實(shí)驗(yàn)中，HPL濃度值達(dá)到700mg/L仍未產(chǎn)生Hook’s效應(yīng)。
l 質(zhì)量控制
良好的實(shí)驗(yàn)操作要求每次用校準(zhǔn)曲線來做質(zhì)控品。測定一批具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的質(zhì)控品，來建立平均值和正常人的濃度值范圍以確保合適的實(shí)驗(yàn)操作。不應(yīng)使用含有疊氮化物的質(zhì)控品。
l 產(chǎn)品限制
1） 做實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)包裝內(nèi)說明書有充分的理解并具有良好的實(shí)驗(yàn)操作，這樣會(huì)獲得可靠得和可重復(fù) 的結(jié)果。
2） 使用本試劑盒得到的結(jié)果應(yīng)該僅作為其它診斷程序的一個(gè)幫助和為內(nèi)科醫(yī)生提供有用的信息。
3） 沖洗步驟很關(guān)鍵。沖洗不充分會(huì)導(dǎo)致度低并使光度值讀數(shù)偏高。
本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
中國*總代理：深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司
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