LumiZol Reagent 設(shè)計(jì)用于從各種來源（植物、動(dòng)物、細(xì)菌和酵母）的細(xì)胞和組織樣品中快速分離 RNA、DNA 和蛋白質(zhì)。 LumiZol Reagent 是一種含有苯酚、異硫氰酸胍以及分離高質(zhì)量核酸和蛋白質(zhì)所需的其他成分的溶液。苯酚和異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞并有效抑制核糖核酸酶，從而保持 RNA 完整。均質(zhì)化并添加氯仿后，樣品分離成上層水相、中間相和下層有機(jī)相。 RNA 可以用異丙醇從上相沉淀，而 DNA 和蛋白質(zhì)可以分別用乙醇和異丙醇從中間相和下層有機(jī)相沉淀。

用于 RNA、DNA 和蛋白質(zhì)分離的樣品：

• 植物和動(dòng)物組織——30-100毫克；

• 貼壁真核細(xì)胞 — 1×10 5至 1×10<sup7< sup="" style="box-sizing: border-box;">;

• 懸浮真核細(xì)胞、酵母 — 5×10 6至 10×10 6；

• 細(xì)菌細(xì)胞 — 1×10 7。

RNA分離

使用新鮮或液氮速凍樣品以獲得最佳 RNA 分離效果。在 LumiZol 試劑中均質(zhì)化之前，請(qǐng)勿解凍樣品。

1. 根據(jù)您的起始材料在 LumiZol 試劑中裂解樣品：

• 組織：在 1 mL LumiZol 試劑中勻漿組織樣本，并將勻漿轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 管中。

• 細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，用 0.5–1 mL LumiZol 試劑重懸細(xì)胞沉淀或單層細(xì)胞，然后將裂解物轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 試管中。

2. （可選）如果樣品脂肪含量高，則將裂解液在 4 °C 下以 12,000 × g 離心 5 分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 管中。

3. 將管在室溫下孵育 5 分鐘。

4. 向裂解液中添加 0.2 mL 氯仿（每 1 mL 用于裂解的 LumiZol 試劑），通過翻轉(zhuǎn)管充分混合，并在室溫下孵育 2 分鐘。

5. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 15 分鐘。離心后，混合物分成兩相：無色水相和黃色有機(jī)相，其間有中間相。

6. 將上層水相轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 管中，不要接觸間相。如果樣品中RNA的量非常少，則在水相中添加共沉淀劑。保留有機(jī)相和界面用于 DNA 和蛋白質(zhì)提取。

7. 向水相中加入0.8體積的異丙醇，充分混合，并在室溫下孵育10分鐘。

8. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘。

9. 棄去上清液，向 RNA 沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇，充分混勻，并在 4 °C 下以 7,500 × g離心管 5 分鐘。

10. 棄去上清液，將 RNA 沉淀風(fēng)干 5-10 分鐘。

11. 將 RNA 沉淀溶解在 50–100 μL 無 RNase 水中。

DNA分離

1. 除去“RNA 分離”部分步驟 5 中獲得的界面上的任何剩余水相。

2. 向界面相和有機(jī)相中添加 0.3 mL 100% 乙醇（每 1 mL 《RNA 分離》步驟 1 中使用的 LumiZol 試劑），通過翻轉(zhuǎn)管混合，并在室溫下孵育 2-3 分鐘。

3. 將管在 4 °C 下以 2,000 × g 離心 5 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 管中。上清液可用于后續(xù)的蛋白質(zhì)提取。

4. 將 DNA 沉淀重懸于 1 mL 檸檬酸鈉/乙醇溶液（10% 乙醇中的 0.1 M 檸檬酸鈉，pH 8.5）中。

5. 孵育 30 分鐘，偶爾混合。

6. 將管在 4 °C 下以 2,000 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

7. 再重復(fù)一次步驟 4-6。

8. 將 1 mL 70% 乙醇添加到 DNA 沉淀中，充分混勻，然后在 4 °C 下以 2,000 × g離心管 5 分鐘。

9. 棄去上清液，將 DNA 沉淀風(fēng)干 5-10 分鐘。

10. 將 DNA 沉淀重懸于 0.3–0.6 mL 的 8 mM 氫氧化鈉中。

11. 將管在 4 °C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 管中，并用 Tris-HCl 緩沖液將 pH 調(diào)節(jié)至 7–8 [添加 5 μL 1 M Tris-HCl 緩沖液（pH 4.5）至300μL DNA溶液]。

蛋白質(zhì)分離

1. 向《DNA 分離》部分第 3 步獲得的上清液中添加 1.5 mL 異丙醇（每 1 mL 《RNA 分離》步驟 1 中使用的 LumiZol 試劑），通過翻轉(zhuǎn)管充分混合，并孵育 10分鐘在室溫下。

2. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘。丟棄上清液。

3. 將蛋白質(zhì)沉淀重新懸浮在 2 mL 鹽酸胍/乙醇溶液（0.3 M 鹽酸胍于 95% 乙醇中）中。

4. 將管在室溫下孵育 20 分鐘。

5. 將管在 4 °C 下以 7,500 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

6. 再重復(fù)步驟 3-5 兩次。

7. 向蛋白沉淀中加入 2 mL 100% 乙醇，充分混勻，室溫孵育 20 分鐘。

8. 將管在 4 °C 下以 7,500 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

9. 將蛋白質(zhì)沉淀風(fēng)干 5-10 分鐘。

10. 將蛋白質(zhì)沉淀溶解在含有 SDS 的緩沖液中（例如，用于將蛋白質(zhì)樣品加載到聚丙烯酰胺凝膠上的樣品緩沖液）。