一、背景

腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒采用SYBR Green染料法實(shí)時熒光PCR技術(shù)，針對腦膜炎敗血金黃桿菌的基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，用熒光PCR技術(shù)對腦膜炎敗血金黃桿菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，在反應(yīng)體系中含腦膜炎敗血金黃桿菌核酸模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號，利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

二、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒使用方法

1、樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

按照試劑盒操作說明或者臨床樣品處理方法做好樣品前處理。

1.2 DNA提取

根據(jù)您實(shí)驗(yàn)室的具體情況和樣品類型，選擇適當(dāng)?shù)奶崛〔呗苑椒ā榱耸箤?shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，樣本核酸提取過程中應(yīng)避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測，建議-15℃以下保存。推薦采用我們公司研發(fā)生產(chǎn)的試劑盒：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)

2、試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

2.1從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強(qiáng)光照射，待溶解后振蕩混勻并低速離心10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費(fèi)。

2.2根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)。

2.3在適當(dāng)容積的無菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后2000 rpm離心10 s，按照20μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián)PCR反應(yīng)管中。

2.4蓋緊八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋,并注意做好相應(yīng)標(biāo)識（請標(biāo)記在八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋兩端突出部位，切勿標(biāo)記在八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋中間）。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。

3、加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過程中應(yīng)避免污染。

4、PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)。

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL。

熒光通道選擇：檢測通道熒光染料法(SYBR Green I)，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

4.3按照腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒說明書設(shè)置循環(huán)參數(shù)

5、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤38.0和典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：檢測結(jié)果Ct值無Ct值，無明顯的擴(kuò)增曲線。

三、應(yīng)用

腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒可以用于金黃桿菌臨床分離株耐藥性分析及β-內(nèi)酰胺酶基因型研究：

1、了解臨床分離金黃桿菌對常用抗菌藥物的耐藥特性;

2、了解金黃桿菌β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生情況;

3、研究金黃桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因型及分布情況。

材料與方法：菌株來源共收集金黃桿菌52株,其中主要為產(chǎn)吲哚黃桿菌和腦膜膿毒性金桿菌,分別為25株和23株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M、接合試驗(yàn)受體菌E.coli C600和銅綠假單胞菌pa119均為本科保存菌株。

方法：瓊脂稀釋法測定18種藥物對52株金黃桿菌的抑菌濃度,三紙片增效法、改良三維試驗(yàn)法進(jìn)行金黃桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶表型篩查,PCR方法和全編碼基因分析β-內(nèi)酰胺酶基因型,接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)和質(zhì)粒DNA的檢測了解β-內(nèi)酰胺酶基因是否具有可轉(zhuǎn)移性,等電聚焦電泳測定β-內(nèi)酰胺酶的pI值。

結(jié)果：52株金黃桿菌對碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南的耐藥率為73.1%,氨曲南為90.4%,阿米卡星和β-內(nèi)酰胺抗生素的耐藥率均大于40%。喹諾酮類藥物加替沙星、左氧氟沙星耐藥率為11.5%、9.6%,以及利福平8.7%,均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性。

金黃桿菌β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果,25株產(chǎn)吲哚黃桿菌的表型和PCR方法分別檢測出MBLs 19株和20株,基因型以bla IND-1和bla IND-2為主,分別為9株和10株,菌株C-15攜帶bla IND-1,MBLs表型檢測及β-內(nèi)酰胺酶初篩均為陰性。

14株腦膜膿毒性金桿菌表型和PCR方法分別檢測出MBLs 17株,基因型為blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株。僅7株細(xì)菌檢出產(chǎn)ESBLs,均為腦膜膿毒性金桿菌,基因型為3株blaCME-1和4株blaCME-2,其中5株細(xì)菌同時檢出MBLs。52株細(xì)菌均未檢出產(chǎn)AmpC酶。攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因的金黃桿菌接合試驗(yàn)均未成功。質(zhì)粒DNA均未檢出β-內(nèi)酰胺酶基因。

結(jié)論：

1、金黃桿菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,對碳青霉烯類等多種抗菌藥物呈高度耐藥;

2、腦膜膿毒性金桿菌具有較高的ESBLs和MBLs攜帶率,基因型分別以blaCME和blaB為主,可同時攜帶兩種MBLs基因,且blaCME常和MBLs基因同時攜帶;

3、產(chǎn)吲哚黃桿菌具有很高的MBLs檢出率,本地區(qū)攜帶的MBLs基因型以bla IND-1和bla IND-2為主。

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