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人抗呼吸道合胞病毒抗體ELISA試劑盒顯色重要性及樣品處理

來源:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司   2013年05月07日 10:38  

人抗呼吸道合胞病毒抗體ELISA試劑盒顯色的重要性

顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應(yīng),此時酶催化無色的底物有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴(yán)格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間,及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,再延長反應(yīng)時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行,顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用酸終止后,顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和SDS等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
人抗呼吸道合胞病毒抗體ELISA試劑盒檢測中樣品的處理
1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:
細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫1000g,離心10分鐘后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:
標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g,4℃離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:
可用EDTA或肝素作為抗凝劑標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃,1000g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.尿液:
無菌收集取初尿,離心除去沉淀物,即可用于檢測,要長期保存尿樣,可以加入0.05%的NaN3在4-8℃保存,或加入尿樣冰凍保護液放入-20℃冰箱長期保存。
5.組織勻漿:
將組織標(biāo)本先用PBS洗滌,除去多余血液,勻漿化后放在PBS于-20℃放置過夜,再經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,5000g,4℃離心5分鐘,取上清即可檢測。
注:取樣和樣品處理過程中,防止有毒物質(zhì)對操作人員的危害,要采取相應(yīng)的保護措施。

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