影響質(zhì)粒提取的因素:
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關,如宿主菌的種類和培養(yǎng)
條件、細胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。
宿主菌種類
質(zhì)粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中,多數(shù)情況下我們是
從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質(zhì)粒提取的
質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列會在裂解時產(chǎn)生大量的糖
類,如果沒有*去除,將抑制后續(xù)實驗中的酶活性,影響質(zhì)粒
DNA提取的質(zhì)量。另外,有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性,會降低
DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA。
培養(yǎng)時間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落,接種到培養(yǎng)物中(含有相關抗生
素的液體培養(yǎng)基中),振蕩培養(yǎng)12-16小時。不應超過16小時,因為這時
細胞開始裂解,使得質(zhì)粒的得率降低,也會導致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
質(zhì)粒擴增
氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,但對松弛型質(zhì)粒的
復制沒有影響。因此,在細菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)
粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,
從而抑制了染色體的復制,但質(zhì)粒復制所用的酶半衰期較長,故質(zhì)
粒仍可繼續(xù)復制,這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量,又可降低細胞的數(shù)量,
使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生長階段都應加入抗生素篩選。現(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不
含有在細胞分裂時確保平均分配的par位點,無質(zhì)粒的子細胞在無
抗生素時復制速度遠大于含質(zhì)粒的細胞。
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