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地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針

來源:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司   2010年07月21日 11:39  

                                                        地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針

1.標(biāo)記DNA探針 每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3?線性的DNA,也可標(biāo)記更大量的DNA,但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

(1)DNA探針熱變性,煮沸10min,迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上,待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及試劑:

新鮮變性的DNA 1-3?

六聚核苷酸混合物 2?(管5)

dNTP標(biāo)記用混合底物 2?(管6)

加無菌重蒸水至 19?

DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow) 1?(管7)

(3)在37℃保溫至少60min,可到20h。

(4)煮沸5min,終止反應(yīng)。

(5)15000rpm離心30s,置于冰上待用。

2.預(yù)雜交 按100cm2膜用20~40ml預(yù)雜交溶液,預(yù)雜交時使溶液處于流動狀態(tài)。

預(yù)雜交液組成:5?SC

0.5%(W/V)封阻試劑(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%(W/V)SDS

膜放入塑料袋,灌入預(yù)雜交液,排除氣體后密封,在65℃預(yù)雜交過夜。

3.雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液,雜交時偶爾搖動雜交袋,使里面的溶液重新分配。

雜交液組成: 50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻試劑

5?SC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%(W/V)SDS

新變性標(biāo)記DNA(150ng/ml)

雜交液取代預(yù)雜交液,替換間膜不能干,成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜(16~20h)。

4.洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。

(1)在室溫下用2?SC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。

(2)在65℃條件下用0.1?SC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。

(3)在室溫下用2?SC溶液漂洗1次。

5.免疫測定

(1)配制溶液

緩沖液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

緩沖液2:0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50~70℃,此溶液保持混濁)。

緩沖液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

緩沖液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

顯色溶液:新鮮配制,在10ml緩沖液3中,加45?NBT溶液(管9)和35?X-磷酸鹽緩沖液(管10)。

2. 顯色過程

A.膜在緩沖液1中短暫洗滌(1min)。

B.在100ml緩沖2中保溫30min。

C.再用緩沖液1短暫洗滌。

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