地高辛配基隨機標記DNA探針
1.標記DNA探針 每次標準的反應(yīng)可標記10ng至3?線性的DNA,也可標記更大量的DNA,但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。
(1)DNA探針熱變性,煮沸10min,迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上,待用。
(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及試劑:
新鮮變性的DNA 1-3?
六聚核苷酸混合物 2?(管5)
dNTP標記用混合底物 2?(管6)
加無菌重蒸水至 19?
DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow) 1?(管7)
(3)在37℃保溫至少60min,可到20h。
(4)煮沸5min,終止反應(yīng)。
(5)15000rpm離心30s,置于冰上待用。
2.預(yù)雜交 按100cm2膜用20~40ml預(yù)雜交溶液,預(yù)雜交時使溶液處于流動狀態(tài)。
預(yù)雜交液組成:5?SC
0.5%(W/V)封阻試劑(管11)
0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
0.02%(W/V)SDS
膜放入塑料袋,灌入預(yù)雜交液,排除氣體后密封,在65℃預(yù)雜交過夜。
3.雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液,雜交時偶爾搖動雜交袋,使里面的溶液重新分配。
雜交液組成: 50%甲酰胺(V/V)
5%(W/V)封阻試劑
5?SC
0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
0.02%(W/V)SDS
新變性標記DNA(150ng/ml)
雜交液取代預(yù)雜交液,替換間膜不能干,成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜(16~20h)。
4.洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液計算。
(1)在室溫下用2?SC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。
(2)在65℃條件下用0.1?SC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。
(3)在室溫下用2?SC溶液漂洗1次。
5.免疫測定
(1)配制溶液
緩沖液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
緩沖液2:0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50~70℃,此溶液保持混濁)。
緩沖液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
緩沖液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
顯色溶液:新鮮配制,在10ml緩沖液3中,加45?NBT溶液(管9)和35?X-磷酸鹽緩沖液(管10)。
2. 顯色過程
A.膜在緩沖液1中短暫洗滌(1min)。
B.在100ml緩沖2中保溫30min。
C.再用緩沖液1短暫洗滌。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。