細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(MTT法)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(MTT法)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程:
(Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit) 以MTT為指示劑,在經(jīng)典操作方法的基礎(chǔ)上,采用了*的甲簪溶解液,可以直接溶解甲簪,而無(wú)需離心去除原有的培養(yǎng)液,故可避免因甲簪部分被吸除而引起的操作誤差,具有本底低,靈敏度高,線性范圍寬,操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。
保存條件
MTT溶液-20℃保存,一年有效;Formazan溶解液室溫或-20℃保存。
使用說(shuō)明
1. 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn),一般可在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。
2. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液。細(xì)胞的數(shù)量取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮团囵B(yǎng)時(shí)間。增殖實(shí)驗(yàn)每孔通常加入103個(gè)以上數(shù)量的細(xì)胞;細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔至少加入5x103個(gè)或以上數(shù)量的細(xì)胞(具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目,需根據(jù)細(xì)胞的大小,細(xì)胞增殖速度的快慢等因素確定)。
3. 接種的細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)需要,送入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。增殖實(shí)驗(yàn)通常要給予0-10微升特定的藥物或生長(zhǎng)因子進(jìn)行刺激。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)通常要給予0-10微升抑制因子或細(xì)胞藥物;
4.培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入20微升MTT溶液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3-6小時(shí);
5.孵育結(jié)束后,每孔加入100微升Formanzan溶解液,在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育,直至在鏡下觀察formazan全部溶解。通常37℃孵育4小時(shí)左右,紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少,溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多,溶解的時(shí)間會(huì)略長(zhǎng)。
6. 在570nm測(cè)定吸光度。如無(wú)570nm濾光片, 560-600nm范圍的濾光片均可使用。
步驟
1、接種細(xì)胞 :用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,每孔體積200ul。
2、培養(yǎng)細(xì)胞 :同一般培養(yǎng)條件,培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。
3、呈色 :培養(yǎng)3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí),終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO,振蕩10分鐘,使結(jié)晶物充分融解。
4、比色 :選擇490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
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