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如何選擇Z佳的全血DNA、RNA提取方法?

來(lái)源:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司   2010年08月03日 10:43  

                           如何選擇*的全血DNA、RNA提取方法?
 

從全血中提取DNA和RNA應(yīng)該說(shuō)是zui基本的工作了,提取的DNA和RNA質(zhì)量的好壞直接影響了下游的實(shí)驗(yàn)和分析,可供選擇的方法非常多,亂花漸欲迷人眼,如何選擇的方法,成了很多人實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前zui難以抉擇的事情。我們從兩個(gè)方面,層層剝繭,分析*的實(shí)驗(yàn)方法。
 
1、  全血的采集保存和DNA的提取
I.       用含抗凝劑的采血管進(jìn)行采血,抗凝劑一般有EDTA和肝素,EDTA更好一些,不會(huì)影響下游的反應(yīng),如果沒(méi)有采血管,也可以自己添加抗凝劑EDTA,提前準(zhǔn)備0.04M的EDTA溶液,每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液,顛倒混勻即可。保存于-20℃至-80℃,一般2-3年內(nèi)均可以提取,保存時(shí)間越短,提取的質(zhì)量越高,在2個(gè)月內(nèi)提取。
II.       DNA提取方法的選擇:全血提取試劑盒一般有離心柱和溶液型兩種(比如Qiagen、Promega、Bioteke;摒棄酚氯仿手提的方法,時(shí)間長(zhǎng)毒性大),原理及步驟基本相同。雖然各公司推出了N多型號(hào),讓人不知如何去選擇,但從原理和操作步驟看,基本就是離心柱和溶液型兩種。一般來(lái)說(shuō),離心柱(DP1801)的提取純度高一些,但是處理量?。?.1-1ml)、得率略低;溶液型(DP2101或DP2201)的提取量大(1-10ml)得率也高于離心柱。醫(yī)院的血液標(biāo)本一般在2ml以上,一般選擇溶液型的方法提取.在說(shuō)到國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口差別的時(shí)候,很多人以為進(jìn)口一定比國(guó)產(chǎn)的好,我們覺(jué)得沒(méi)有,只有更好!在不斷的進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化之后,全血基因組DNA提取試劑盒DP2101或DP2201開(kāi)創(chuàng)了第三代技術(shù),不需要蛋白酶K消化,進(jìn)口的都是要借助蛋白酶K的啊!DP2101或DP2201減少了蛋白酶K現(xiàn)配現(xiàn)用的麻煩和消化的時(shí)間,而且提取量和穩(wěn)定性更好。
III.     非抗凝血(凝固血)能否提???答案是肯定的,而且一點(diǎn)都不麻煩,提取效果和抗凝血沒(méi)有差別!
2、  全血RNA如何提取
I.       全血RNA提取過(guò)程哪些是RNA降解的因素?
全血中RNA酶是非常豐富的,RNA在沒(méi)有保護(hù)的狀態(tài)下很容易降解!哪些是狀態(tài)RNA不受保護(hù)呢,比如紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞的過(guò)程,紅細(xì)胞裂解液是低濃度的平衡鹽溶液,沒(méi)有抑制RNase的成份,這時(shí)候RNA不受保護(hù);DNA酶消化的時(shí)候RNA也不受保護(hù),這個(gè)時(shí)候也沒(méi)有抑制RNase的成份。
II.    什么樣的提取方法更好?
我們?cè)谶x擇方法的時(shí)候要傾向于對(duì)RNA全程有保護(hù)的方法!一般的方法都是先用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,然后從白細(xì)胞提取核酸,還要經(jīng)過(guò)DNA酶的消化去除DNA,這種并不是的方法,過(guò)程中有很多RNA降解的因素。所以直接裂解法是的方法,將采集的血液迅速加入3倍體積的裂解液RLS——RP4001血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)的裂解液,迅速顛倒混勻。裂解液RLS含有強(qiáng)烈的蛋白變性劑,能迅速變性蛋白,是RNase變性,不能對(duì)RNA降解。裂解后的混合液還可以用來(lái)運(yùn)輸,以避免RNA降解,這個(gè)方法成為博奧生物制作表達(dá)譜芯片RNA運(yùn)輸和提取的推薦方法
環(huán)境微生物DNA提取方法的突破
農(nóng)藥、除草劑、各種污染物、人工合成物等異生物質(zhì),對(duì)環(huán)境和土壤微生物的多樣性、種群變化產(chǎn)生明顯影響;轉(zhuǎn)基因作物是否發(fā)生土壤基因轉(zhuǎn)移的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)等
方面的研究,都需要準(zhǔn)確的提取高質(zhì)量的DNA進(jìn)行檢測(cè)!
 
土壤中可培養(yǎng)的微生物可能不及所有微生物總數(shù)的0.3%,常規(guī)提取DNA的方法很難提取到DNA,很難把土壤中的腐殖酸去除干凈,而微量的腐殖酸就可能導(dǎo)致PCR失敗。
 
目前上商用的試劑盒雖然能提取到土壤中微生物的DNA,但由于破碎方法采用玻璃珠或者鋼珠破碎,導(dǎo)致基因組斷裂嚴(yán)重,影響DNA質(zhì)量;第二,由于必須購(gòu)買破碎的破碎機(jī)或振蕩器,增加其使用成本;第三,其試劑盒為了保證DNA純度,采用了包括玻璃奶、離心吸附柱串聯(lián)的純化方式,導(dǎo)致了DNA大量的損失,得率很低,很難真正反映出土壤中微生物的多樣性。
土壤基因組DNA快速提取試劑盒(DP4001)采用創(chuàng)新技術(shù),摒棄了機(jī)械破碎細(xì)胞的方法,采用酶法破碎,保證了基因組的完整性,摒棄了玻璃奶、離心吸附柱串聯(lián)純化DNA的方式,極大的提高了DNA的得率,幾乎土壤中所有的微生物DNA都能提取出來(lái),能真正反映土壤中微生物的多樣性!

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