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配制percoll細(xì)胞分離液

來源:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司   2010年08月31日 14:45  

                                                               配制percoll細(xì)胞分離液

(一) 原理

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高達(dá)1.3g/ml密度,采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200~1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由 于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低,所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外,Percoll不穿透生物膜,對(duì)細(xì)胞無毒害,因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒, 還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。

(二)操作方法及注意事項(xiàng)

1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。

Percoll濃度(%)  70    60    50    40    30     20

比重g/ml   1.090         1.077         1.067          1.056            1.043               1.031

2.  不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤(rùn),除去多余血清,這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從 高密度向低密度逐層放置,有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí),可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。

3. 裝樣:樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異,一般加樣體積不宜過大,細(xì)胞濃度也不可過高,否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。

4. 離心:一般采用離心力為400g,時(shí)間20~25min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢,要平穩(wěn)。

5. 取樣:當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí),可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。

(三)分離純化細(xì)胞舉例

1. 富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的 Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2~1.5ml,初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×108懸于1ml培 基中,按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5%與45%Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。

2. 純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞:分別疊加50%和30%Percoll液。收取經(jīng)PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異 型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者),按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞;兩層Percoll之間為淋巴母細(xì)胞,純度和回收率在 80%以上,位于30%Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

(四) 人不同血細(xì)胞的漂浮密度

表   人不同血細(xì)胞的漂浮密度

──────────────┬──────────────────

細(xì) 胞   漂浮密度    │ 細(xì) 胞       漂浮密度

──────────────┼──────────────────

紅細(xì)胞  1.09-1.11    │淋巴細(xì)胞       1.052-1.077

粒細(xì)胞           │ B淋巴細(xì)胞      1.062-1.075

嗜酸性  1.09-1.095    │ T淋巴細(xì)胞      1.065-1.077

嗜中性  1.080-1.085   │ 淋巴母細(xì)胞     1.065-1.077

單核細(xì)胞 1.050-1.066   │自然殺傷細(xì)胞     1.050-1.070

血小板  1.030-1.060   │

──────────────┴────────────────── 

 

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