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2018
05-17

重組蛋白分離純化的基本原則
不管黑貓白貓，抓到老鼠就是好貓，對純化來講亦如此，能拿到純度好的蛋白，符合純化要求就是硬道理。不同蛋白純化工藝不同，即使相同的原料也有不同的純化方案。蛋白質(zhì)純化方法的選擇主要是利用不同蛋白質(zhì)之間的相似性與差異，依據(jù)蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，在根據(jù)蛋白的差異性將目的蛋白分離出來，所以要取得好的純化結(jié)果所可以采用的策略及原則卻是共通的。1.針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采用不同的策略：a)融合型表達(dá)重組蛋白，一般胞內(nèi)可溶性的，擬選用親和層析進(jìn)行純化；b)分泌型表達(dá)的重組蛋白，通常體積大、濃度低，因
2018
05-17

細(xì)胞固定對抗體熒光強(qiáng)度的改變
多聚甲醛固定后，白細(xì)胞的免疫表型通常會有所變化。而且，在固定之后，對細(xì)胞表面Marker的熒光穩(wěn)定性也會產(chǎn)生很大影響。為了獲得不同表面Marker的熒光穩(wěn)定性，了解固定后細(xì)胞的光散射特性和射門以及固定細(xì)胞后產(chǎn)生自發(fā)熒光是非常必要的。在固定細(xì)胞0、2、4、6、24、48、96h后，用FITC標(biāo)記抗體對全血進(jìn)行染色測定。通過檢測可溶性熒光素當(dāng)量分子(MESF)來定量分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示出，固定作用48h后，細(xì)胞大小（FSC）和細(xì)胞顆粒度(SSC)能夠引起顯著的下降，在單核細(xì)胞中，固定作用96h后，
2018
05-16

免疫磁珠技術(shù)
免疫磁珠（Immunomagneticbead,IMB）技術(shù)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的技術(shù)方法。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化及分子遺傳學(xué)等各個領(lǐng)域，其在免疫檢測、細(xì)胞分離、生物大分子純化和分子生物學(xué)等方面有著越來越廣泛的使用。免疫磁珠的結(jié)構(gòu)：磁珠是由核心金屬顆粒（Fe2O3,Fe3O4）,核心外層包裹的高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）和zui外層的功能配基（如-NH2，-COOH、-OH、-CHO）組成。免疫磁珠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：1.細(xì)胞分選免疫磁珠細(xì)胞分選可在幾分鐘
2018
05-16

大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的策略
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是發(fā)展zui早、目前zui為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等，是基礎(chǔ)研究和商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的強(qiáng)大工具；但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如重組蛋白不穩(wěn)定，生物活性低，以包涵體形式表達(dá)。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率受多個因素的影響，在表達(dá)前對目的蛋白進(jìn)行分析和優(yōu)化，才能實現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)，主要包括如下幾個方面：(1)表達(dá)載體的選擇，表達(dá)載體啟動子的選擇很重要，啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與R
2018
05-15

DNA 甲基化修飾
DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，能通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)想、穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)相互作用方式等，起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個重要因素。這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態(tài)。它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethy-transferase，Dnmt）催化，以3-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體而發(fā)生反應(yīng)。催化反應(yīng)有3類，包括將腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甲基腺嘌呤、將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甲基胞嘧啶以及將
2018
05-15

His 融合蛋白純化常見問題解答
蛋白過鎳柱純化的原理：Ni-NTA純化介質(zhì)純化帶有His6-Tag的融合蛋白是目前蛋白純化中zui常使用的一種方法。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白)標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是6個組氨酸(堿性氨基酸)。在蛋白上樣后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合，采用咪唑洗脫，咪唑競爭性結(jié)合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。上樣，清洗，洗脫，基本三個步驟就結(jié)束
2018
05-14

多色流式實驗熒光素的選擇
流式細(xì)胞儀已經(jīng)成為臨床醫(yī)生、免疫學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家*的工具，這項技術(shù)在不斷進(jìn)步。流式細(xì)胞儀的多參數(shù)細(xì)胞分析這一*的功能讓大多數(shù)細(xì)胞分析成為了可能。Coon首先提出了熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白技術(shù)，在20世紀(jì)80年代，細(xì)胞亞群僅僅通過檢測單一的細(xì)胞表面標(biāo)志物來確定，使用的單抗和熒光素很受限制?；虮磉_(dá)技術(shù)的誕生和新的單抗以及熒光素的獲得使更復(fù)雜的多參數(shù)分析成為可能。1.常用熒光素的種類及特性1）.FITC（Fluorescein）又稱異硫氰酸熒光素，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光
2018
05-14

貼壁、懸浮、原代細(xì)胞感染Protocol及常見問題解答
慢病毒是當(dāng)前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。然而仍有一部分細(xì)胞，尤其是原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞由于細(xì)胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細(xì)胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑，然而細(xì)胞狀態(tài)卻變差了，且增加感染效率并沒有達(dá)到理解的效果，這是什么原因呢？一、對慢病毒感染出現(xiàn)的問題進(jìn)行原因分析1.細(xì)胞狀態(tài)變差——細(xì)胞毒性雜質(zhì)：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白
2018
05-11

如何提高PCR產(chǎn)物克隆的效率
把PCR產(chǎn)物克隆到載體上常見有3種做法：1.直接克隆到T載體（或者U載體上）2.引物設(shè)計時引入酶切位點，PCR產(chǎn)物酶切后直接克隆到目標(biāo)載體上3.將平末端PCR產(chǎn)物直接克隆到平末端酶切載體上。方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同時具有熱啟動功能的高保真ProofStart酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于這類酶有很強(qiáng)的校讀功能，能夠以模版為準(zhǔn)切掉錯配的堿基，因而得到的PCR產(chǎn)物多數(shù)是平末端，不能
2018
05-11

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測分析
PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成之后，必須通過嚴(yán)格的鑒定，才能確定是否真正得到了準(zhǔn)確可靠的預(yù)期特定擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠電泳是檢測PCR產(chǎn)物常用和zui簡便的方法，能判斷產(chǎn)物的大小，有助于產(chǎn)物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNApian段大于100bp者，后者主要用來檢測小片段DNA。1．瓊脂糖凝膠電泳這是實驗室zui常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進(jìn)行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下
2018
05-10

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達(dá)的研究；（3）廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)相關(guān)研究。平端連接法實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoRV或SmaI切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的V
2018
05-10

脂肪組織和細(xì)胞的總蛋白提取
脂肪組織特別是白色脂肪組織（WAT）已經(jīng)被證實除了具有能量儲存功能外，還與內(nèi)分泌和器官炎癥有關(guān)。從脂肪組織中提取和分析蛋白質(zhì)對于了解許多生理/病理狀態(tài)越來越重要。但是由于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中高脂肪和低蛋白含量，所以在技術(shù)上挑戰(zhàn)性。*目前生物樣品中水油乳化物zui難分離，具有*表面性質(zhì)的帶孔徑的離心管柱和優(yōu)化的無表面活性劑的緩沖液系統(tǒng)，可以快速有效的從脂肪組織勻漿中將水油乳化物分離。提取緩沖液比脂肪組織中的油冰點低，脂肪組織勻漿通過離心管柱能將水相和油相迅速分開，組織中
2018
05-04

丙烯酰胺凝膠電泳
丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇
2018
05-04

感受態(tài)細(xì)胞制作
方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時，挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlS
2018
04-28

抗體和重組蛋白使用保存方法
無論是保存還是運輸，請避免反復(fù)凍融。反復(fù)凍融，冰晶會破壞抗體和重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白變性形成多聚體和重組蛋白構(gòu)象改變，從而降低抗體的結(jié)合能力，也加快了抗體球蛋白和重組蛋白的降解速度。抗體和重組蛋白保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體和重組蛋白的活性使用效果，如果保存得當(dāng)，的抗體和重組蛋白活性大部分都可以維持?jǐn)?shù)年。1.收到抗體和重組蛋白后的操作收到抗體和重組蛋白后（大部分抗體和重組蛋白是溶液態(tài)），請務(wù)必在4℃，12000rpm，離心3分鐘，再打開管蓋進(jìn)行分裝、溶解和保存（如果抗體和重組蛋白體積小于5
2018
04-28

重組羧肽酶B 的性質(zhì)與抗體堿性峰檢測
羧肽酶B(EC3.4.17.2)專一用于蛋白質(zhì)C-末端堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）的水解；又稱為肽酰-L-賴氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量為35kD，等電點為6.0，zui適pH為7-9。羧肽酶B是抗體堿性峰檢測的特異酶，通過比較酶切前和酶切后的圖譜來計算抗體堿性變體的比例，對于抗體的發(fā)酵工藝和純化工藝穩(wěn)定性的控制都具有重要的意義。而在抗體堿性峰的檢測中，沒有*統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如酶解緩沖液酶的用量，酶解時的溫度和時間等。而這些與酶的性質(zhì)密切相關(guān)。可以選擇的羧肽酶B有兩種，一種是動
2018
04-27

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR，rtpcr）
實驗方法原理逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。實驗材料組織細(xì)胞試劑、試劑盒RNA提取試劑dNTP混合物TaqDNA聚合酶*鏈cDNA合成試劑盒儀器、耗材離心管離心機(jī)水浴鍋PCR管電泳儀凝膠圖像分析系統(tǒng)移液管移液槍離心管
2018
04-27

實驗室裝柱要點
空柱的準(zhǔn)備準(zhǔn)備步驟：空柱中篩網(wǎng)需要定期用0.5M的NaOH超聲清洗，并且用20%乙醇排除氣泡，內(nèi)部接一定要確保擰緊，各個部件組裝完成后用水檢查氣密性。將空柱用柱夾固定，連接到層析儀中，保證水平和垂直，對于凝膠過濾填料的裝填，需要用水平儀檢查。填料勻漿的準(zhǔn)備反復(fù)使用的填料：需要對填料進(jìn)行再生，如果填料再生后仍然結(jié)塊明顯，攪拌后部分為絮狀或者有色素沉著，建議選用新填料。新填料：填料儲存液通常為20%乙醇，裝柱溶液根據(jù)填料的不同而不同，可能是水溶液，鹽溶液或者是有機(jī)溶液等。將上述已經(jīng)交換到裝柱溶液中的
2018
04-26

病毒的細(xì)胞感染
慢病毒、腺病毒和AAV是常用的三種病毒載體，其各自的特點如下表。實際操作中，可根據(jù)不同的實驗需求選擇合適的病毒。慢病毒因其具有感染譜廣、表達(dá)時間長、安全性高等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞感染，是細(xì)胞實驗的首xuan工具。下面以不同癌種細(xì)胞模型的感染效果來展示慢病毒應(yīng)用于細(xì)胞感染方面的表現(xiàn)。一、慢病毒感染不同癌種細(xì)胞模型效果圖1.膠質(zhì)瘤細(xì)胞2.肺癌細(xì)胞
2018
04-26

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的測定法
1.實驗原理染色單體或染色體的無著絲點斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。大小應(yīng)為主核的1/20～1/5。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，所以可用簡易的、快速、靈敏的微核計數(shù)來代替繁雜的畸變?nèi)旧w計數(shù)。Matter和Schmid建立的微核測試是一種比較理想的方法，目前國內(nèi)外已把微核測試用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗、

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