線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）/BestBio-貝博生物

使用方法：

    使用注意事項(xiàng)：

• 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
• JC-1在溫度較低時(shí)會(huì)凝固，可以20～25℃水浴溫育片刻全部融解后離心使用。
• 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
• 配制染色工作液時(shí)，JC-1容易形成聚集體，所以需要邊振蕩邊加。若仍有不溶的顆粒，可在13000 ×g離心1分鐘，吸取離心后的上清使用。
• 始終保持平衡染液中pH值的*性，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。
• 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。
• 根椐細(xì)胞種類、實(shí)驗(yàn)條件不同流式細(xì)胞儀設(shè)置不同。
• JC-1液產(chǎn)生沉淀離心取上清使用即可，不影響結(jié)果。
• JC-1染色并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。

懸浮細(xì)胞

1、孵育緩沖液和JC-1染色工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制孵育緩沖液和JC-1染色工作液。取100ul 10×孵育緩沖液加900ul無菌純水稀釋，混勻并預(yù)熱至37℃，即成1×孵育緩沖液；在500ul 1×孵育緩沖液中加入5ul JC-1，渦旋混勻配成JC-1染色工作液；

2、收集樣本細(xì)胞以及陰性、陽性對(duì)照細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量在2-5X10⁵個(gè)。

3、用PBS洗滌細(xì)胞兩次。離心收集細(xì)胞。

4、用500ul JC-1染色工作液將細(xì)胞重懸，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘。

5、常溫離心收集細(xì)胞。

6、用500ul預(yù)熱的孵育緩沖液將細(xì)胞重懸。

7、用流式細(xì)胞儀或熒光分光光度計(jì)檢測(cè)分析結(jié)果，或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

貼壁細(xì)胞

對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

純化線粒體

1、把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1孵育緩沖液(1×)稀釋5 倍。

2、0.9mL 5倍稀釋的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100ug的純化的線粒體。

3、結(jié)果檢測(cè)。

組織樣本

組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細(xì)胞懸液后按照細(xì)胞樣本的方法檢測(cè)。也可以用其他細(xì)胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測(cè)。

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）/BestBio-貝博生物

結(jié)果分析 ：

檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，綠色熒光通過FL1通道檢測(cè)；紅色熒光通過FL2通道檢測(cè)。FL-1+,FL-2+為正常細(xì)胞，FL-1+,FL-2—為凋亡細(xì)胞。

用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如PI或Cy3時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm 時(shí)，可以在475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。

參考文獻(xiàn)：

• Gang Wang, JunJie Wang, Jie Luo et al.        

PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells

Journal of Biomedical Materials Research     2013       （IF=2.625）

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