帕金森氏病(PD)是第二常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性疾病.近年來,諸多研究表明microRNA-7(miR-7)在帕金森氏病中發(fā)揮著非常重要的保護作用.然而, miR-7的生物學作用和在PD中的分子機制仍不清楚.本研究擬利用1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)對多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用,采用不同劑量的MPP+誘導人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞發(fā)生細胞凋亡,建立穩(wěn)定的急性PD細胞模型.該研究通過采用流式細胞術(shù),原位末段標記(TUNE L)檢測DNA斷裂,JC-1染色檢測線粒體膜電位(ΔΨm),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性檢測以及核小體的富集程度等多種手段對細胞凋亡的檢測,充分證明了miR-7在PD細胞模型中發(fā)揮的保護作用,高表達的niR-7可以有效抑制MPP+誘導的神經(jīng)細胞凋亡,減少末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記陽性率,降低線粒體膜電位,減弱caspase 3的活性和核小體的富集程度.Bax和沉默調(diào)節(jié)蛋白2(SIRT2)是的miR-7的直接靶基因.此外,通過分別過表達Bax和Sirt2,可以抵消miR-7的作用.Bax和Sirt2下游相關(guān)分子的表達也參與了miR-7對MPP+誘導的神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)控作用.這些發(fā)現(xiàn)無疑揭開了PD治療的新篇章,有潛在的應(yīng)用意義.部分建立穩(wěn)定的急性帕金森病細胞模型研究方法1.采用不同濃度IPP+(0,1,2,4mM)作用于SH-SY5Y細胞,作用時間持續(xù)24 h,終選取合適濃度的MPP+作用于SH-SY5Y細胞,建立帕金森病的細胞模型.2.針對已建立的帕金森病細胞模型,采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性.3.采用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧水平.4.乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒檢測細胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶活性.結(jié)果1.加入不同濃度的MPP+時,SH-SY5Y細胞中細胞活性隨MPP+濃度增加而下降.2.采用濃度為4 mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞建立帕金森病的細胞模型.3.mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞時,細胞內(nèi)活性氧水平明顯升高.4.mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞時釋放的乳酸脫氫酶活性明顯升高.結(jié)論4 mM的MPP+作用于SH-SY5Y細胞時的影響了細胞的活性,促進細胞內(nèi)活性氧的生成,細胞所釋放乳酸脫氫酶的活性明顯升高,可建立穩(wěn)定的急性帕金森損傷模型.第二部分上調(diào)miR-7表達對帕金森病的細胞模型生物學作用的影響研究方法1.加入不同濃度的MPP+ 的 SH-SY5Y細胞,分別轉(zhuǎn)染miR-7 mimics和miR-NC, CCK-8法檢測各組細胞增殖和生長能力.2.將細胞分為四組:空白組(miR-NC轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞),實驗組(miR-7 mimics轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞),模型組(4mM 的 MPP+作用SH-SY5Y細胞,轉(zhuǎn)染miR-NC),治療組(4mM的MPP+作用SH-SY5Y細胞,轉(zhuǎn)染miR-7).3.活性氧檢測試劑盒,乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒檢測細胞毒性.4. AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù),原位末段標記(TUNEL)檢測DNA斷裂,JC-1染色檢測線粒體膜電位(△Ψm),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性檢測以及核小體的富集程度檢測細胞凋亡.結(jié)果1.miR-7明顯提高不同濃度處理的MPP+的SH-SY5Y細胞的活性.2.miR-7降低MPP+作用于SH-SY5Y細胞所產(chǎn)生的細胞毒性.3.miR-7顯著抑制帕金森病細胞模型中SH-SY5Y細胞的凋亡.結(jié)論miR-7可抑制MPP+所誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的凋亡,降低其對細胞的毒性作用.因此, miR-7可以作為一種神經(jīng)保護劑,為緩解和治療帕金森病提供了新的策略和潛在的可能性.第三部分miR-7在帕金森病細胞模型中靶基因的預(yù)測與驗證研究方法1.采用TargetScan, miRanda和PicTar等靶基因預(yù)測軟件,預(yù)測miR-7可能靶向Bax和Sirt2基因.2.構(gòu)建野生型和突變型Bax和Sirt2基因3'-UTR片段雙熒光素酶報告載體,并分別與miR-7或miR-NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,檢測熒光值.3.在帕金森病細胞模型的SH-SY5Y細胞中轉(zhuǎn)染miR-NC, miR-7mimics,分別采用qPCR和Western blo t檢測Bax和Sirt2 mRNA和Bax和Sirt2蛋白的表達變化.結(jié)果1. Bax和Sirt2基因3'-UTR各有一個序列片段可能與miR-7結(jié)合.2.雙熒光素酶實驗顯示,miR-7高表達可顯著抑制轉(zhuǎn)染Bax和Sirt2野生型片段細胞的熒光素表達;而當將結(jié)合位點突變后,上述抑制作用喪失.3. miR-7高表達抑制Bax 和 Sirt2基因mRNA和蛋白表達.結(jié)論miR-7可靶向抑制人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞Bax和Sirt2基因的表達,并在MPP+誘導的帕金森病細胞模型中1niR-7與Bax和Sirt2基因mRNA和蛋白表達均呈負相關(guān),miR-7在MPP+誘導的帕金森病細胞模型中的低表達與Bax和Sirt2所參與的細胞凋亡通路有關(guān).第四部分miR-7 對 Bax 和 Sirt2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機制的研究研究方法1.在不同濃度MPP+處理的SH-SY5Y細胞中單獨或共轉(zhuǎn)染miR-7和Sirt2, Western blot檢測Sirt2 和 Bim.2.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性檢測細胞凋亡.3.在SH-SY5 Y細胞中單獨或共轉(zhuǎn)染miR-7和Bax, Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2, Bax, Cl-caspase 3和Cyt c的表達.4.線粒體膜電位(△Ψm),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性以及核小體的富集程度檢測細胞凋亡.結(jié)果1.在SH-SY5Y細胞模型中高表達miR-7可抑制Bax和Sirt2的表達;共轉(zhuǎn)染miR-7和Bax或Sirt2,外源性Bax或Sirt2的表達減弱miR-7對MPP+處理的SH-SY5Y細胞模型的保護作用.2.高表達miR-7抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡,共轉(zhuǎn)染Bax或Sirt2可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象.3.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性檢測,JC-1染色檢測線粒體膜電位(△Ψm),以及核小體的富集程度均顯示共轉(zhuǎn)染Bax或Sirt2可逆轉(zhuǎn)miR-7對SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用.4.在MPP+誘導的帕金森病細胞模型中,高表達miR-7抑制SH-SY5Y細胞中促凋亡蛋白Bim, Cl-caspase 3和Cyt c的表達,促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,共轉(zhuǎn)染Bax或Sirt2則促進Bim, Cl-caspase 3和Cyt c的表達,抑制Bcl-2的表達.結(jié)論miR-7作為帕金森病潛在的保護基因,可通過其靶基因Bax和Sirt2調(diào)控細胞凋亡信號通路,抑制神經(jīng)元細胞的凋亡.miR-7通過抑制其靶基因Bax和Sirt2的表達,影響凋亡相關(guān)分子的表達,進而發(fā)揮對細胞凋亡的抑制作用,可能為利用microRNAs治療帕金森病提供一定的理論依據(jù).