平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)(PRM) :

PRM是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段(如發(fā)生翻譯后修飾的肽段)進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行絕對(duì)定量。PRM技術(shù)基于Q-Orbitrap為代表的高分辨、高精度質(zhì)譜平臺(tái)，首先

利用四級(jí)桿質(zhì)量分析器的選擇能力，用Q1選擇目標(biāo)肽段的母離子,隨后在Collision cell中對(duì)母離子進(jìn)行碎裂，最后利用

Orbitrap分析器在二級(jí)質(zhì)譜中檢測(cè)所選擇的母離子窗口內(nèi)的所有碎片信息。這樣即可對(duì)復(fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行準(zhǔn)確地特異性分析。

實(shí)驗(yàn)意義:

PRM技術(shù)是針對(duì)無(wú)抗體蛋白的驗(yàn)證新技術(shù)，用于label free, iTRAQ, TMT, SILAC等相對(duì)定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，或?qū)?fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向定量分析。

實(shí)驗(yàn)步驟:

用PRM進(jìn)行蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)驗(yàn)證的一般步驟為:

結(jié)果展示

實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn):

1.實(shí)驗(yàn)周期: --般PRM時(shí)間為: 5-10天

2.交付標(biāo)準(zhǔn):

組學(xué)驗(yàn)證:

①主要儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)方法。

②PRM目標(biāo)離子信息:肽段序列和定量子離子。

③方法學(xué)重復(fù)性評(píng)價(jià):三次技術(shù)重復(fù)的色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) (預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果) 。

④實(shí)驗(yàn)結(jié)果:二級(jí)圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，矯正后的相對(duì)表達(dá)量，兩組樣本間的相對(duì)比值，ttest p值。

相對(duì)/絕對(duì)定量:

①主要儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)方法。

②PRM目標(biāo)離子信息:肽段序列和定量子離子。

③方法學(xué)評(píng)價(jià):相對(duì)定量的重復(fù)性評(píng)價(jià)-測(cè)試樣本的三次技術(shù)重復(fù)的色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) (預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果) ;

絕對(duì)定量的方法學(xué)評(píng)價(jià)-標(biāo)準(zhǔn)品XIC圖譜，LOD， LOQ,線性范圍， 6個(gè)稀釋梯度得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性公式(每個(gè)稀釋度有3次技術(shù)重復(fù))。

④實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

相對(duì)定量:二級(jí)圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，矯正后的相對(duì)表達(dá)量，兩組樣本間的相對(duì)比值，ttest p值。

絕對(duì)定量:二級(jí)圖譜，XIC圖譜,原始峰面積強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的蛋白質(zhì)濃度值，兩組樣本間的相對(duì)比值，ttest p值。

需確認(rèn)的信息:

1.樣品:

①如果樣品為蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)總量≥300mg;

②如果是組織樣品，樣品總量≥0.1g;如果是細(xì)胞樣品，細(xì)胞數(shù)量≥107個(gè);

③如果是體液樣品，血清≥200ml，腦脊液≥200ml, 尿液≥1ml,淚液≥1ml。

2.樣品采集過(guò)程中使用到塑料制品時(shí)，盡量使用無(wú)色進(jìn)口產(chǎn)品，以減少塑料制品中雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的影響。

文獻(xiàn)參考

[1] Navin Rauniyar. Parallel Reaction Monitoring: A Targeted Experiment Performed Using High Resolution and HighMass Accuracy Mass Spectrometry. IntJ Mol Sci. 2015 Dec; 16(12): 28566- -28581.