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實驗步驟:

一、試劑準備

1. SDS-PAGE試劑: 見聚丙烯酰.胺凝膠電泳實驗。

2.勻漿緩沖液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巰基Z醇0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.

3.轉膜緩沖液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至1000 ml.

4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;加ddH20至1000ml。

5.膜染色液:考馬斯亮蘭0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配) :脫脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。

6.顯色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸鎳胺0.1 ml; H202 1.0 μl。

二、蛋白樣品制備

1.單層貼壁細胞總蛋白的提取

(1)倒掉培養(yǎng)液， 并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或將瓶直立放置一釓使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

(2)每瓶細胞加3 ml 4°C預冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

(3)按1m裂解液加10 μl PMSF (100 mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)

(4)每瓶細胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。

(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(動作要快)， 然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 mI離心管中。(整個操作盡量在冰 上進行。)

(6)于4°C下12000 rpm離心5 min。(提前開離心機預冷)

(7)將離心后的.上清分裝轉移倒0.5 m的離心管中放于- 20°C保存。

2.組織中總蛋白的提取

(1)將少量組織塊置于1 ~ 2 m勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。

(3)幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上， 要重復碾幾次使組織盡量碾碎。

(4)裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 mI離心管中,然后在49C下12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20°C保存。

3.加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取

由于受藥物的影響，一些細胞脫落 下來，所以除按1操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取:

(1)將培養(yǎng)液倒至15 m|離心管中，于2500 rpm離心5 min.

(2)棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復洗滌--次。

(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

(4)將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20C保存。

三、蛋白含量的測定

1.制作標準曲線

(1) 從- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室溫融化后,備用。

(2)取18個1.5 mI離心管, 3個-組，分別標記為0 mg, 2.5mg, 5.0mg，10.0 mg, 20.0mg， 40.0mg。

(3)按下表在各管中加入各種試劑。

(4)混溝后， 室溫放置2 min。在生物分光光度計(Bio-Photometer, Eppendorf). 上比色分析。

2.檢測樣品蛋白含量

(1)取足量的1.5 m離心管，每管加入4°C儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。 室溫放置30 min后即可用于測蛋白。

(2)取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。

(3)空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用無菌水洗- -次。

(4)取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5 mI待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意:每測一個樣品都要將比色杯用無水Z醇洗2次，無菌水洗- -次。 可同時混合好多個樣品再一起測，

這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結果是5 mI樣品含的蛋白量。

四、SDS- PAGE電泳

1.清洗玻璃板

--只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

2.灌膠與上樣

(1)玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時要 使兩玻璃對齊以免漏膠。)

(2)按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 m槍吸取5 m膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。(灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠-定要沿玻璃板流下， 這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。)

(3)當水和膠之間有一條折射線時， 說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

(4)按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待

到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

(5)用水沖洗-下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內， 大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另- -邊要墊一塊塑料板且有字的- -面面向外。)

(6)測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 m離心管中，加入5xSDS.上樣緩沖液至終濃度為1x。( 上樣總體積-般不超過15 μl,加樣孔的最大限度可加20 μ樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

(7)加足夠的電泳液后開始準備上樣。(電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。 )用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣 品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下-個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

3.電泳

電泳時間一般4 ~5h,電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。

五、轉膜

1.轉一 張膜需準備6張7.0~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時-定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的- 邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸

濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一-層空 氣膜，這樣會阻止膜吸水。

2.在加有轉移液的搪瓷盤 里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、-支玻棒、濾紙和浸過的膜。

3.將夾子打開使黑的一 面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上)，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

4.要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬-會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。(撬時一 定要小心，玻板很易裂。)除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作)，要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。(轉移液含甲醇， 操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。)

5.將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h. .

6.轉完后將膜用1x麗春紅染液染5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。

六免疫反應

1.將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。

2. 將抗用TBST稀釋至適當濃度(在1.5 m離心管中) ;撕下適當大小的-塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗-次，10 min.

3.同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1 ~2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗- -次， 10 min,進行化學發(fā)光反應。

七、化學發(fā)光,影，定影

1.將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合; 1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸; 1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液，包好,放入X-光片夾中。

2. 在暗室中,將1x顯影液和定影液分別到入塑料盤中;在紅燈下取出X -光片，用切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大1 cm) ;打開X-光片夾，把X -光片放在膜上，- 旦放上,便不能移動，關上X光.陜，開始計時;根據信號的強弱適當調整曝光時間，-般為1 min或5 min,也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果;曝光完成后，打開X-光片夾， 取出X-光片, 迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間-般為1~2 min (20~ 25°C)，溫度過低時(低于16°C) 需適當延長顯影時間;顯影結束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間-般為5 ~ 10 min,以膠片透明為止;用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

應注意的是:顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片,否則會對結果產生影響。

八凝膠圖象分析

將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

展開

注意事項:

1.一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。

2.顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。

3. DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。

其他:

一、免疫反應

1.用0.01 M PBS洗膜，5 min x3次。

2.加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2 h。

3.棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 minx3次。

4.加入一抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部)，49C 放置12 h以上。陰性對照，以1%BSA取代-抗，其余步驟與實驗組相同。

5.棄-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分別洗膜，5 minx4次。

6.加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動，室溫2 h。

7.棄二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 minx4次。

8.加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。