產(chǎn)品簡介

游離膽//固//醇(FC)是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也是合成性激素、膽汁酸、維生素D和腎上腺皮質(zhì)激素等物質(zhì)的重要原料，F(xiàn)C濃度可作為脂代謝的指標(biāo)。本試劑盒的檢測方法是微量法，既可以用可見分光光度計(jì)檢測，也可以用酶標(biāo)儀檢測。該產(chǎn)品的檢出限是0.119 μmol/mL，線性范圍為0.125-6 μmol/mL。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-膽甾烯酮和H2O2，過氧化物酶催化H2O2、4-氨基安//替//比//林和酚生成紅色醌類化合物，其在500 nm有吸收峰，顏色深淺與FC含量成正比。作用方式如下：

測定總膽//固//醇(TC)請選擇60723ES 總膽//固//醇(TC)含量檢測試劑盒；測定游離膽//固//醇(FC)請選擇60724ES 游離膽//固//醇(FC)含量檢測試劑盒。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲存條件

2~8℃保存，有效期6個月。

使用說明

【注意事項(xiàng)】實(shí)驗(yàn)之前建議選擇3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)，建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

1. 需自備的儀器和溶劑：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、EP管、蒸餾水和異丙醇。

2. 溶液的配制：

1）自備提取液異丙醇：大約需要110 mL，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個30 mL棕色空瓶，僅做分裝使用。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置：10 mg膽//固//醇使用前加入517 μL提取液，振蕩溶解后即為50 μmol/mL的膽//固//醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，2~8℃可保存4周。

3）標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取50 μmol/mL膽//固//醇標(biāo)準(zhǔn)液20 μL ，加入480 μL異丙醇，充分混勻，配制成2 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。注意2 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)驗(yàn)中每管需10 μL，但為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制體積偏大。

3. 操作步驟

1）樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

a. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000 g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測。

b. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300 w，超聲2秒，間隔3秒，總時間3 min）；然后 8000 g，4℃離心10 min， 取上清置于冰上待測。

c. 血清（漿）等液體樣本：直接測定，若有沉淀請離心后取上清待測。

2）測定步驟

a. 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至500 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

b. 按需取出一定量的工作液，37℃水浴預(yù)熱30 min。

c. 在1.5 mL EP管/96孔板按下表步驟加樣

3. 總膽//固//醇含量計(jì)算

a. 血清（漿）中 FC 含量計(jì)算：

FC含量（μmol/dL）=C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×100=200×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）

b. 組織或細(xì)胞、細(xì)菌中 FC 含量計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：FC含量（μmol/mg prot）=C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A 空白）×V樣總÷（Cpr×V樣總）=2×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：FC 含量（μmol/g 質(zhì)量）=C 標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣總÷W=2×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W

（3）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：FC 含量(μmol/104 cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣總÷N=（A測定-A 空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）

C 標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，2 μmol/mL；V 樣總：加入提取液的體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；100：單位換算系數(shù)，1 dL=100 mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，500萬；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì)。

4. 實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取 0.1 g 大鼠肝臟加入 1 mL 提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用 96孔板測得A空白=0.046、A標(biāo)準(zhǔn)=0.354、A測定=0.127，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

FC含量（μmol/g 質(zhì)量）=2×（A測定-A空白）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W =5.320 μmol/g 質(zhì)量。

注意事項(xiàng)

1. 如果樣本吸光值大于1.2，建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測定。

2. 提取液中含有使蛋白變形的成分，故按蛋白濃度計(jì)算時需要重新提取蛋白進(jìn)行測定。

3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

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