做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，其實發(fā)現(xiàn)WB想要做好并不難，總結了WB實驗中可能會遇到的問題，分析了可能的原因及對應的解決方案，希望能成為你實驗成功的基石。

問題1：轉膜不充分

(1)膜沒有*均勻濕透

使用100% methanol浸透膜。

(2)靶蛋白分子量小于10 000

選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間。

(3)靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值

可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液。

(4)甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替。

(5)轉移時間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間。

問題2：背景高

(1)膜沒有*均勻濕透

使用100% methanol浸透膜。

(2)洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數(shù)。

(3)阻斷不充分

增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

(3)二抗?jié)舛冗^高

降低二抗?jié)舛取?/span>

(4)檢測過程中膜干燥

保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。

(5)曝光過度

縮短曝光時間。

(6)抗體與阻斷蛋白有交叉反應

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應。

問題3：沒有陽性條帶

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間。

（2）酶失活

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物。

（3）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

（4）試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。

（5）一抗失效

選擇在有效期內抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液。

（6）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有*。

問題4：有陽性條帶，但條帶比較弱

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時間。

（2）酶活性降低

直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物。

（3）標本中靶蛋白含量太低

增加標本上樣量。

（4）洗膜過度

縮短洗滌時間。

（5）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有*。

（6）抗體活性降低

選擇在有效期內的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置。

（7）封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型。

（8）曝光時間過短

延長曝光時間。

（9）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有*。 

問題5：條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶

（1）二抗的非特異性結合

增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）。

（2）一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性。

（3）蛋白降解

使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑。

（4）二聚體或多聚體存在

增加蛋白質變性過程及強度。

（5）抗體濃度過高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶。

（6）蛋白上樣量過大

降低上樣量。

問題6：背景有斑點

（1）封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑。

（2）HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體。

問題7：膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶）

（1）HRP含量過高

降低酶聯(lián)二抗的濃度。

其它方面：