ELISA 注意事項

1) 確保所有的試劑在使用前已經(jīng)達到室溫（除非指明要保持低溫的）。

2) 如果你不打算用完整塊平板，確保剩余的8聯(lián)管放回有干燥劑的平板袋中并密封，以防受潮使產(chǎn)品效果下降。

3) 對于不是一次性使用的標(biāo)準(zhǔn)品，把剩余的標(biāo)準(zhǔn)品小量分裝并凍存。這使標(biāo)準(zhǔn)品免于反復(fù)凍融。

4) 多通道移液槍可使你的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加樣能力加快，并取得一致性更高的結(jié)果。

5) 移液操作進行放液時槍頭與垂直方向偏離一點角度，不要觸碰樣品孔底部。

6) 復(fù)孔樣品加樣時不需要換槍頭；為避免樣品污染，取不同樣品或標(biāo)準(zhǔn)品時要換槍頭。

7) 如有可能盡量使用洗板機，不熟練的手工洗板可能導(dǎo)致高背景。

8) 在洗板時，無論是手工還是用洗板機，在兩次洗滌中增加30秒的浸潤時間，以確保洗滌的效果。

9) 注意孵育時間，通用的建議是每小時的孵育時間的誤差要控制在+/-5分鐘以內(nèi)。

10) 如果實驗要求在2-8度的低溫孵育，而且你同時進行多塊板的操作，不要把平板互相疊放，要并排分別放置。

抗原和抗體*工作濃度的確定

抗原抗體反應(yīng)要求在zui適比例條件下進行，ELISA反應(yīng)試劑多，其工作濃度不同對結(jié)果影響較大，因此必須對包被抗原(抗體)和酶標(biāo)抗體(抗原)進行*工作濃度的滴定和選擇，以達到*的測定條件。

方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度 用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強陽性參考血清A值；為0．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度。

方陣(棋盤)法選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度 將抗體用包被液稀釋為10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三個濃度按行包被，每一個濃度包被三行(每行3孔)，分別在每個濃度包被的*、二、三行中分別加入強陽性抗原，弱陽性抗原和陰性對照，將酶標(biāo)抗抗體用稀釋液稀釋為1:l 000、l:5000、l:10000三個濃度，分別加入每個濃度包被的*、二、三列中。加底物顯色，加酸終止反應(yīng)，分別讀取A值。以強陽性抗原液A值在0.8左右，陰性參考A值<0.1的條件為zui適條件。據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的*工作濃度。

抗體的稀釋度及稀釋液的測定方法

抗體的稀釋度包括特異性抗體，中間抗體及標(biāo)記抗體。任何一種免疫組化方法要想得到令人滿意的染色效果，必須將抗體進行*稀釋。一般來說，抗體的稀釋度取決于下列因素。

(一)抗體的濃度(亦稱滴度)

每毫升溶液內(nèi)所含抗體分子越多，滴度就越高，該抗體可高度稀釋，尤其是特異性一抗的稀釋度。一般商品化抗體只知道每毫升含多少抗體蛋白量，不知道所含抗體分子。自己制備抗體可通過瓊脂糖雙擴散或放射免疫法進行測定。商品化抗體一般告知大約的稀釋度，例如用PAP法可1：100～1：200稀釋。但往往購買到一種新抗體后，需要利用組織切片進行*稀釋度的測定。

(二)稀釋度的測定方法

在測定抗體*稀釋度時，可將陽性強度與背景染色以“+”形式來表達，“+ + + +”為*陽性，“+ + +”為強陽性，“+ +”為弱強陽性，“+”為弱陽性，“一”為陰性。

1．直接測定法

按表2—4稀釋抗體，4℃過夜，觀察分析結(jié)果。從表2—4的結(jié)果中可知，400為*稀釋度，因其特異性染色強，且背景低。

表2-4 抗體稀釋度的直接測定法

一抗稀釋度 特異性染色強度 非特異性 一抗稀釋度 特異性染色強度 非特異性

l： 50 + + + + + + l：400 + + + (一)

1：100 + + + + + + 1：500 + + (一)

1：200 + + + + + 陰性對照 (一) (一)

1：300 + + +

2．棋盤稀釋測定法

按表2—5稀釋、測定，從表中顯示的結(jié)果可知，一抗1：100、二抗1：200為*稀釋度。

表2-5 抗體稀釋度的棋盤稀釋測定法

第二抗體 一抗稀釋度

1 ： 50 l：100 1：200 1：400

1：100 + + + +(+ +) + + + +(+ +) + + +(一) +(一)

1：200 + + + +(土) +++(一) + +(一) +(一)

1：400 + +(一) +(一) (一) (一)

注：括號內(nèi)為背景染色

(三)抗體的配制

抗體的配制及使用是開展免疫組織化學(xué)工作的一個重要環(huán)節(jié)，其檢測的結(jié)果既要可靠，又要能重復(fù)，這就要求實驗人員在配制抗體過程中要注意其度。目前，隨著抗體稀釋液的穩(wěn)定性提高，一次稀釋抗體可用一年。當(dāng)然，還可以購買到商品化即用型一抗，使用非常方便。

(四)抗體稀釋液的種類

可根據(jù)需要選擇不同的抗體稀釋液。如稀釋當(dāng)天用完的一抗，用0．05m01／L(pH7.6)TBS即可。如需長期保存，可用如下稀釋液：取0．1g明膠(或綠色明膠)溶在100ml0.05m01／L(pH7．6)TBS緩沖液中，邊攪拌邊加熱至60℃，待*溶解后，冷卻至室溫，加入1g牛血清白蛋白，zui后加入200mg aN3，分裝保存在一40℃中備用。另外，抗體原液應(yīng)分裝后一40℃保存，可保存5年以上。