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生殖器皰疹患者單一核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α、 白介素6和HLA－Ⅱ類抗原表達(dá)的研究
生殖器皰疹（GH）隨著性病發(fā)病率上升而增多，其病原體單純皰疹病毒2（HSV－2）與某些生殖器惡性腫瘤密切相關(guān)[1]。在抗HSV感染中，細(xì)胞免疫起著重要作用，我們研究了生殖器皰疹患者外周血單一核細(xì)胞分泌白介素6（IL－6）、腫瘤壞死因子α（TNF－α）水平及人白細(xì)胞Ⅱ類抗原（HLA－Ⅱ類抗原）表達(dá)的改變，探討生殖器皰疹發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制。
一、材料與方法
（一）研究對(duì)象：
1.診斷指標(biāo)：①在生殖器部位發(fā)現(xiàn)典型簇集性小水皰或有簇集性點(diǎn)狀糜爛結(jié)痂者，或既往有反復(fù)發(fā)生的生殖器皰疹史。②血清抗HSV－2IgG陽(yáng)性。③排除其它疾病如梅毒、白塞病、非性病生殖器潰瘍等。
2.臨床資料：患者符合診斷指標(biāo)者27例,男21例,女6例,年齡21～48歲。病程在1個(gè)月以內(nèi)者6例，半年至1年者12例，1年以上者9例。初發(fā)5例,發(fā)作次數(shù)2～5次11例，6～10次6例，10次以上5例。發(fā)生于冠狀溝6例，包皮處10例，陰莖處6例，龜頭處4例，女陰6例。簇集性水皰者11例，點(diǎn)狀糜爛結(jié)痂者21例。發(fā)作前有明顯誘因2例，無(wú)誘因25例。發(fā)作時(shí)伴有癢感5例，伴有疼痛8例，伴有燒灼感5例，無(wú)明顯自覺(jué)癥狀10例。所有患者近期均未接受過(guò)免疫治療，且無(wú)自身免疫性及其他感染性疾病。對(duì)照組為健康獻(xiàn)血員20例，年齡、性別與患者組相近。
（二）方法：
1.單一核細(xì)胞分離：抽取靜脈血，肝素抗凝，經(jīng)Ficoll－Hypaque密度梯度離心法，分離獲得單一核細(xì)胞，用*RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清，青、鏈霉素各100U/mL）調(diào)細(xì)胞為2×106/mL，將上述細(xì)胞懸液加入有蓋玻片12孔培養(yǎng)板中,每孔1mL，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱粘附3h，取出蓋玻片，用預(yù)溫D－Hanks液輕輕洗2次，風(fēng)干,純丙酮固定4～5min，－20℃保存待測(cè)。
2.單一核細(xì)胞培養(yǎng):將2×106/mL細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)瓶中，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中粘附3h，棄去非粘附細(xì)胞，用預(yù)溫D－Hanks液洗細(xì)胞2次,加入含脂多糖1μg/mL的*RPMI1640培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，1500r/min離心10min，收集上清液，－20℃保存待測(cè)。
3.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)上清液中TNF－α、IL－6含量，非標(biāo)記抗體橋聯(lián)酶標(biāo)記技術(shù)（APAAP法）檢測(cè)HLA－Ⅱ類抗原表達(dá)率。TNF－α，IL－6ELISA試劑盒，APAAP試劑盒由北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司提供。
（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:兩組間均數(shù)比較t檢驗(yàn)。
1.診斷指標(biāo)：①在生殖器部位發(fā)現(xiàn)典型簇集性小水皰或有簇集性點(diǎn)狀糜爛結(jié)痂者，或既往有反復(fù)發(fā)生的生殖器皰疹史。②血清抗HSV－2IgG陽(yáng)性。③排除其它疾病如梅毒、白塞病、非性病生殖器潰瘍等。
2.臨床資料：患者符合診斷指標(biāo)者27例,男21例,女6例,年齡21～48歲。病程在1個(gè)月以內(nèi)者6例，半年至1年者12例，1年以上者9例。初發(fā)5例,發(fā)作次數(shù)2～5次11例，6～10次6例，10次以上5例。發(fā)生于冠狀溝6例，包皮處10例，陰莖處6例，龜頭處4例，女陰6例。簇集性水皰者11例，點(diǎn)狀糜爛結(jié)痂者21例。發(fā)作前有明顯誘因2例，無(wú)誘因25例。發(fā)作時(shí)伴有癢感5例，伴有疼痛8例，伴有燒灼感5例，無(wú)明顯自覺(jué)癥狀10例。所有患者近期均未接受過(guò)免疫治療，且無(wú)自身免疫性及其他感染性疾病。對(duì)照組為健康獻(xiàn)血員20例，年齡、性別與患者組相近。
（二）方法：
1.單一核細(xì)胞分離：抽取靜脈血，肝素抗凝，經(jīng)Ficoll－Hypaque密度梯度離心法，分離獲得單一核細(xì)胞，用*RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清，青、鏈霉素各100U/mL）調(diào)細(xì)胞為2×106/mL，將上述細(xì)胞懸液加入有蓋玻片12孔培養(yǎng)板中,每孔1mL，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱粘附3h，取出蓋玻片，用預(yù)溫D－Hanks液輕輕洗2次，風(fēng)干,純丙酮固定4～5min，－20℃保存待測(cè)。
2.單一核細(xì)胞培養(yǎng):將2×106/mL細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)瓶中，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中粘附3h，棄去非粘附細(xì)胞，用預(yù)溫D－Hanks液洗細(xì)胞2次,加入含脂多糖1μg/mL的*RPMI1640培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，1500r/min離心10min，收集上清液，－20℃保存待測(cè)。
3.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)上清液中TNF－α、IL－6含量，非標(biāo)記抗體橋聯(lián)酶標(biāo)記技術(shù)（APAAP法）檢測(cè)HLA－Ⅱ類抗原表達(dá)率。TNF－α，IL－6ELISA試劑盒，APAAP試劑盒由北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司提供。
（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:兩組間均數(shù)比較t檢驗(yàn)。
表1 生殖器皰疹患者單一核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平和HLA-I類抗原表達(dá)水平的改變（ ±s）
| 組別 | 例數(shù) | TNF-A（ng/mL） | IL-6（ng/mL） | HLA -DQ（%） | HLA -DR （%） |
| 對(duì)照組 | 20 | 4.68±0.54 | 6.46±1.94 | 37.63±1.79 | 81.03±1.32 |
| 患者組 | 27 | 3.13±0.44 | 3.32±1.06 | 29.54±1.5 | 67.48±1.51 |
| t值 | | 2.24 | 4.01 | 4.09 | 6.23 |
| P值 | | <0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.01 |
| 二、結(jié)果 經(jīng)脂多糖刺激后，生殖器皰疹患者外周血單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF－α、IL－6水平均低于對(duì)照組，差異有顯著性（P均<0.05）；生殖器皰疹患者外周血單一核細(xì)胞HLA－DR、HLA－DQ抗原表達(dá)率也均低于對(duì)照組，差異有顯著性（P均<0.01），見(jiàn)表1。 三、討論 TNF－α、IL－6均是機(jī)體內(nèi)作用廣泛的細(xì)胞因子，在脂多糖作用下主要由活化的單核／巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，適量的TNF－α能殺傷病毒感染細(xì)胞，具有抗病毒作用，它也可刺激皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)IL－1、IL－6、干擾素－β的合成，增進(jìn)白細(xì)胞的趨化性，發(fā)揮抗病毒介質(zhì)作用。IL－6具有調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖分化，輔助T細(xì)胞增生活化，抗病毒等生物學(xué)效應(yīng)。研究證明[2]，多種病毒如HIV、HSV及流感病毒等可使宿主細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子能力發(fā)生改變，從而影響病毒性疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生殖器皰疹患者單一核細(xì)胞在LPS刺激下分泌TNF－α、IL－6水平較正常對(duì)照組明顯降低，TNF－α、IL－6水平低下。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生殖器皰疹患者單一核細(xì)胞HLA－Ⅱ類抗原表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致單一核細(xì)胞抗原呈遞能力下降，其功能受抑或降低，不能有效地殺傷靶細(xì)胞，從而使病毒得以生長(zhǎng)繁殖。 |
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