人補(bǔ)體因子H前體（pre-CFH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒
使用說明書
                                                                                 
本試劑盒僅供體外研究使用!
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中pre-CFH含量。

實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗pre-CFH抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗pre-CFH抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的pre-CFH呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為40 ug/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）后，分別稀釋成40 ug/ml，20 ug/ml，10 ug/ml，5 ug/ml，2.5 ug/ml，1.25 ug/ml，0.625 ug/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ug/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制20 ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 40 ug/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μl/孔），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份

自備物品
1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）
2.   微量加液器及吸頭，EP管
3.   蒸餾水或去離子水，全新濾紙

標(biāo)本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4. 樣本處理：血清或血漿標(biāo)本*稀釋10倍，如：稀釋10倍，取10uL血清或血漿加入90uL樣品稀釋液。
注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

注：
1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
    建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.  自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人pre-CFH，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。*使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不*之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月

相關(guān)產(chǎn)品：

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TGF-b3 重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β3 CYT-368 Recombinant Human Transforming Growth Factor-Beta 3
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TGF-b1 （113 a.a.）  重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1（113 a.a.） CYT-679 Recombinant  Human Transforming Growth Factor-Beta 1 （113 a.a.）
TGF-b3 CHO 重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β3 CHO CYT-685 Recombinant Human Transforming Growth Factor-Beta 3, CHO
4-1BBR  CYT-463 Recombinant Human 4-1BB Receptor
4-1BBL  CYT-649 Recombinant Human 4-1BB Ligand
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mTNF-a 重組小鼠腫瘤壞死因子-α CYT-252 Recombinant Mouse Tumor Necrosis Factor-alpha
rTNF-a 重組大鼠腫瘤壞死因子-α CYT-393 Recombinant Rat Tumor Necrosis Factor-alpha
rpTNF-a 重組豬腫瘤壞死因子-α CYT-405 Recombinant Porcine Tumor Necrosis Factor-alpha
TNF-a Mutant 重組人腫瘤壞死因子-α Mutant CYT-384 Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha, Mutant
TNF-b 重組人腫瘤壞死因子-β CYT-224 Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-beta
TNF-b His 重組人腫瘤壞死因子-β His CYT-495 Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-beta, His Tag
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TNFR1 His 重組人腫瘤壞死因子受體1 CYT-707 Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1, His
TNFR1 重組人腫瘤壞死因子受體1 CYT-673 Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1
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TRAIL （114-281 a.a.） 人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子配體 CYT-546 Recombinant Human TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand/Apo2L （114-281）