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【摘要】 目的 探討IL-4、紫杉醇對Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響。方法 將Lewis肺癌細(xì)胞（1.25×106個/鼠）接種于C57BL/6小鼠皮下。將40只小鼠隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，接種后第5天起分別給予生理鹽水、IL-4、紫杉醇和IL-4＋紫杉醇。第18天處死動物。利用圖像分析儀對腫瘤細(xì)胞核形態(tài)、DNA含量及AgNORs 計數(shù)進(jìn)行測量。結(jié)果?、蚪M核面積為（24.202±5.012）?μm2，周長（18.625±4.180）?μm，平均直徑（2.642±0.291）?μm，積分光密度3.412±0.910，AgNORs計數(shù)5.313±0.820，各項(xiàng)參數(shù)數(shù)值均顯著小于Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅲ組核面積為（18.373±4.833）?μm2，周長（16.522±2.518）?μm，平均直徑（2.401±0.288）?μm，積分光密度3.096±0.771，AgNORs計數(shù)2.670±0.401，均顯著小于Ⅰ組（P＜0.01）；Ⅳ組核面積為（16.664±4.671）?μm2，周長（15.901±2.700）?μm，平均直徑（2.283±0.308）?μm，積分光密度2.707±0.807，AgNORs計數(shù)1.552±0.316，均顯著小于Ⅰ組（P＜0.01）。各用藥組間各參數(shù)差異亦具有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論 IL-4和紫杉醇對Lewis肺癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，紫杉醇療效較IL-4好，而兩者聯(lián)用療效更好。
Effects of IL-4 and taxol on cellular proliferation of Lewis lung cancer
HU Xuefeng LIU Mingqiu YU Lunyin CHEN Deji JIANG Man LIU Xiaoyi XIA Dong ZHANG Zhengbing
?。―epartment of Pathology, Hubei Medical University, Wuhan, Hubei 430071, P.R.China）
【Abstract】 Objective To investigate the effects of IL-4 and taxol on cellular proliferation of Lewis lung cancer （LLC）. Methods LLC cells （1.25×106/mouse） were inoculated subcutaneously to 40 mice, which were randomized into 4 groups and given responsive treatment consecutively in 5 days after inoculation. For group Ⅰ natrii chloride was injected, for group Ⅱ IL-4 at 50?ng／d for 7 days, for group Ⅲ taxol at 10?mg／（kg*d） for 10 days, and for group Ⅳ IL-4 and taxol were injected altogether at 50?ng／d for 7 days and 5mg／（kg*d） for 10 days respectively. On the 18th day, all the mice were killed. Nuclear morphometry, DNA contents and AgNORs were detected by image analysis. Results Nuclear area, perimeter, mean diameter, DNA contents, and AgNORs counting in group Ⅱ were 24.202±5.012?μm2, 18.626±4.180?μm, 2.642±0.291?μm, 3.412±0.910, and 5.313±0.820 respectively, which were significantly less than those in group Ⅰ （P＜0.05）; the parameters in group Ⅲ were 18.373±4.833?μm2, 16.522±2.518?μm, 2.401±0.288?μm, 3.096±0.771, and 2.670±0.401 respectively, which were much less than those in group Ⅰ （P＜0.01）; the parameters in group Ⅳ were 16.664±4.761?μm2, 15.901±2.700?μm, 2.283±0.308?μm, 2.707±0.807, and 1.552±0.316 respectively, which were remarkably less than those in group Ⅰ （P＜0.01）. Significant differences of the parameters were observed among group Ⅱ and Ⅲ and Ⅳ （P＜0.05）. Conclusion Both IL-4 and taxol can remarkably inhibit the proliferation of LLC. The effect of combined treatment is most significant, and the effect of taxol is higher than that of IL-4.
【Key words】 Lung neoplasms IL-4 Taxol DNA contents Nucleolar organizer region
IL-4是機(jī)體免疫應(yīng)答過程中的重要調(diào)控因子，可促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞分化、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化及殺傷作用，對腫瘤的生長也有顯著的抑制作用［1］。紫杉醇是一種從太平洋紫杉屬短葉紫杉莖皮中提取的抗腫瘤藥物，它屬于細(xì)胞周期G2／M期阻滯劑，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明它對卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、淋巴瘤、白血病及頭頸部腫瘤均有較好的療效［3、4］。本研究使用IL-4、紫杉醇單用及聯(lián)用治療Lewis肺癌，觀察腫瘤細(xì)胞核形態(tài)、DNA含量及AgNORs計數(shù)的改變。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL／6小鼠40只，雌雄各半，體重為18～22g，購自中國醫(yī)學(xué)*醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所。
1.1.2 Lewis肺癌可移植性瘤株 自中國醫(yī)學(xué)*藥物研究所藥理室購荷瘤C57BL/6小鼠，經(jīng)體內(nèi)傳代保種。
1.1.3 L929傳代細(xì)胞系 購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。
1.1.4 鼠重組IL-4 購自英國Peprotech公司。
1.1.5 紫杉醇注射液 中國醫(yī)學(xué)*藥物研究所方起程老師惠贈，濃度為6mg/ml，批號970110。
1.1.6 Feulgen 染液 ①無色品紅液；②0.5％偏重亞硫酸鈉水溶液；③0.2％亮綠水溶液；④1N鹽酸水溶液。
1.1.7 AgNO3染液?、偌滓海?％明膠；②乙液：50％AgNO3；③工作液（臨用配制）：甲液∶乙液為1∶2。
1.1.8 圖像分析儀 TJTY-300型，同濟(jì)太陽電子公司產(chǎn)品。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法 在C57BL／6小鼠的右腋皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞，接種量為1.25×106個活細(xì)胞，接種后將動物隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半，并編號，第5天開始給藥。
Ⅰ組為對照組：由Ⅰa 5只、Ⅰb 5只作兩種條件對照。Ⅰa每日每只腫瘤局部皮下注射生理鹽水0.2ml，連用10天。Ⅰb每日每只腹腔注射生理鹽水0.2ml，連用10天。
Ⅱ組為IL-4組：每日每只瘤周注射IL-450ng，連用7天［5］。
?、蠼M為紫杉醇組：每日每只腹腔注射紫杉醇10mg／kg，連用10天［6］。
?、艚M為IL-4、紫杉醇合用組：每日每只腹腔注射紫杉醇5mg／kg，連用10天，瘤周注射IL-4 50ng，連用7天。
接種腫瘤后第18天處死動物。分離皮下腫瘤結(jié)節(jié)，取局部腫瘤行甲醛固定，常規(guī)透明、浸蠟、包埋、切片，F(xiàn)eulgen染色、嗜銀染色。
1.3 數(shù)據(jù)收集 將Feulgen染色切片在高倍鏡（10×40）下觀察細(xì)胞核，選擇無重疊者為測試對象，由圖像分析儀測腫瘤細(xì)胞核的面積、周長、平均直徑、形狀因子、積分光密度等參數(shù)。每張切片測100個腫瘤細(xì)胞核［7］，結(jié)果經(jīng)微機(jī)處理，得出每組各參數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，然后組間比較，得出P值。
將嗜銀染色切片在油鏡（10×100）下隨機(jī)觀察2個視野，由圖像分析儀測平均每個視野胞核的數(shù)目、顆粒的數(shù)目，單個顆粒的面積、周長、平均直徑、形狀因子、數(shù)密度、面密度、AgNORs計數(shù)等參數(shù)。其中形狀因子、數(shù)密度、面密度、AgNORs計數(shù)按以下公式計算：
形狀因子＝周長2／4π×面積
數(shù)密度＝AgNORs顆粒數(shù)／視野面積
（每個視野面積由微機(jī)得出為3694.18μm2）
面密度＝AgNORs顆粒數(shù)×顆粒面積/視野面積
AgNORs計數(shù)＝AgNORs顆粒數(shù)/胞核數(shù)
結(jié)果經(jīng)微機(jī)處理，得出每組各參數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較，得出P值。
用SAS統(tǒng)計包進(jìn)行方差分析，再進(jìn)行student's-T-Test。
2 結(jié)果
2.1. 小鼠存活情況?、馻、Ⅰb兩種條件對照組各參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其差異無顯著性（P＞0.05）。Ⅲ組于接種后第7、8天各有一只動物死亡。Ⅳ組中紫杉醇劑量減半，雖與IL-4聯(lián)用，卻無動物死亡。
2.2 Lewis肺癌細(xì)胞形態(tài)測量和DNA含量測定 經(jīng)Feulgen染色的組織切片，核呈深紅色，胞漿不著色。Ⅰ組核大，多呈空泡狀，染色質(zhì)聚集成塊，核分布緊密，核漿比例大（圖1）。用藥組核縮小，染色質(zhì)均勻分布，核間隙增寬，核漿比例縮?。▓D2）。從Ⅰ組至Ⅳ組，核面積、周長、平均直徑、積分光密度均依次減小，而形狀因子均依次增大（表1）。上述參數(shù)各用藥組與對照組比較：Ⅱ與Ⅰ比，差異有顯著性（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ與Ⅰ比，差異有顯著性（P＜0.01）。各用藥組之間比較：Ⅲ、Ⅳ與Ⅱ比，差異有高度顯著性（P＜0.01）；Ⅳ與Ⅲ比，差異有顯著性（P＜0.05）。這說明，用藥后腫瘤細(xì)胞體積縮小，生長受抑制，核DNA含量（積分光密度值）降低，腫瘤細(xì)胞核增殖能力減弱。其中聯(lián)合用藥效果，其次為單用紫杉醇組。
圖1. 組Ⅰ腫瘤結(jié)節(jié)組織切片，核大，分布緊密，多呈空泡狀，異型性大 Feulgen染色 ×466
Fig 1 Histological section of tumor for group Ⅰ （The nucleus became big and dense in distribution, most cases with vaculization and obvious atypia. Feulgen staining ×466）
圖2. 組Ⅲ腫瘤結(jié)節(jié)組織切片，核明顯縮小，色深，核間隙增寬 Feulgen染色 ×466
Fig 2 Histological section of tumor for group Ⅱ （The nucleus minified obviously and became dark in color with increased nuclear gap. Feulgen staining ×466）
表1 不同組間核形態(tài)參數(shù)和DNA含量（ ±s）
Tab 1 Nuclear morphometric parameters and DNA contents of different groups （ ±s）
| Parameters | Group Ⅰ | Group Ⅱ | Group Ⅲ | Group Ⅳ |
| Area（μm2） | 37.037±7.027 | 24.202±5.012 | 18.373±4.833 | 16.664±4.671 |
| Perimeter（μm） | 22.762±4.312 | 18.625±4.180 | 16.522±2.518 | 15.901±2.700 |
| Mean diameter（μm） | 3.136±0.351 | 2.642±0.291 | 2.401±0.288 | 2.283±0.308 |
| Form factor | 1.113±0.065 | 1.141±0.075 | 1.186±0.081 | 1.207±0.084 |
| Integral optical density | 4.294±0.992 | 3.412±0.910 | 3.096±0.771 | 2.707±0.807 |
2.3 AgNORs顆粒計數(shù)測定 組織切片行銀染，細(xì)胞核呈淡黃色，AgNORs呈棕褐色顆粒狀。光鏡下，Ⅰ組AgNORs顆粒多為彌散型，少見單一型和混合型。從第Ⅱ組至Ⅳ組，混合型和單一型逐漸增多，第Ⅳ組主要表現(xiàn)為單一型（圖3、4、5）。從第Ⅰ組至第Ⅳ組，胞核的數(shù)目，顆粒的面積、周長、平均直徑均依次增大，而其它各參數(shù)均依次減小（表2）。以上參數(shù)各用藥組與對照組比較：Ⅱ與Ⅰ比，差異有顯著性（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ與Ⅰ比，差異有顯著性（P＜0.01）。各用藥組之間比較：Ⅲ、Ⅳ與Ⅱ比，差異有顯著性（P＜0.01）；Ⅳ與Ⅲ比，差異有顯著性（P＜0.05）。這說明，從Ⅰ組至Ⅳ組，平均每個視野胞核的數(shù)目增多，胞核的體積就相對縮小，腫瘤細(xì)胞生長受到抑制，而AgNORs顆粒的體積逐漸增大，AgNORs計數(shù)逐漸減小。同樣聯(lián)合用藥效果，單用紫杉醇組較好。
圖3 .Ⅰ組腫瘤結(jié)節(jié)組織切片，AgNORs顆粒多而小，多為彌散型 銀染 ×1165
Fig 3 Histological section of tumor for group Ⅰ （The AgNORs granule increased in amount but minified, and appeared diffused-type in most cases. Silver staining ×1165）
圖4 .Ⅲ組腫瘤結(jié)節(jié)組織切片，AgNORs顆粒少而大，彌散型 銀染 ×1165
Fig 4 Histological section of tumor for group Ⅲ （The AgNORs granule decreased in amount but magnified, and appeared mixed-type in most cases. Silver staining ×1165）
圖5 .Ⅳ組腫瘤結(jié)節(jié)組織切片，AgNORs顆粒少而大，多為單一型，少為混合型 銀染 ×1165
Fig 5 Histological section of tumor for group Ⅳ （The AgNORs granule decreased in amount but magnified. The simple-type was predominant than mixed-type. Silver staining ×1165）
表2 不同組間AgNORs顆粒測定（ ±s）
Tab 2 The detection of AgNORs in different groups（ ±s）
| Parameters | Group Ⅰ | Group Ⅱ | Group Ⅲ | Group Ⅳ |
| X1 | 5.500±1.195 | 6.700±2.214 | 7.200±2.486 | 8.763±2.997 |
| X2 | 41.993±6.960 | 35.597±4.880 | 19.224±3.858 | 13.600±2.169 |
| X3（μm2） | 0.675±0.112 | 0.744±0.118 | 1.130±0.252 | 1.767±0.371 |
| X4（μm） | 3.119±0.378 | 3.236±0.390 | 3.813±0.501 | 4.674±0.751 |
| X5（μm） | 0.437±0.026 | 0.501±0.030 | 0.581±0.031 | 0.665±0.034 |
| X6 | 1.147±0.152 | 1.120±0.035 | 1.024±0.059 | 0.984±0.066 |
| Z（×10－3） | 7.673±2.506 | 7.170±2.365 | 5.880±1.613 | 6.505±2.112 |
| Y（×10－3） | 11.370±2.076 | 9.363±2.007 | 5.204±1.683 | 3.681±1.136 |
| P | 7.635±1.160 | 5.313±0.820 | 2.670±0.401 | 1.552±0.316 |
注：X1：平均每個視野胞核的數(shù)目；X2：平均每個視野顆粒的數(shù)目；X3：顆粒的面積；X4：顆粒的周長；X5：顆粒的平均直徑；X6：顆粒的形狀因子；Z：顆粒的數(shù)密度；Y：顆粒的面密度；P：AgNORs計數(shù)。其中X6＝X42／4π·X3 Z＝X2·X3／3694.18 Y＝X2／3694.18 P＝X2／X1。
X1：number of nuclear in a view；X2：number of granule in a view；X3：area of granule；X4：perimeter of granule；X5：mean diameter of granule；X6：form factor of granule,equal X42／4π*X3；Z：number density of granule,equal X2*X3／3694.18；Y：area density of granule，equal X2／3694.18；P：AgNORs count,equal X2／X1.2.4 核DNA含量與AgNORs計數(shù)的關(guān)系 表1、2顯示，從Ⅰ組至Ⅳ組，DNA含量（積分光密度值）依次減少，AgNORs計數(shù)亦依次減小。DNA含量高的組別，其AgNORs計數(shù)亦高，反之亦然。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩者呈直線正相關(guān)，r為0.9611，P＜0.01。
3 討論
圖像分析儀能夠客觀、準(zhǔn)確、直接地獲得數(shù)據(jù)，隨著計算機(jī)圖像分析技術(shù)的發(fā)展和普及，采用圖像分析儀檢測細(xì)胞的形態(tài)及組織細(xì)胞化學(xué)成份的含量，特別是DNA含量的工作越來越多。藥物對腫瘤的療效在組織切片中主要反映在細(xì)胞核上，因此我們選定了細(xì)胞核的形態(tài)參數(shù)作為實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)。細(xì)胞核形態(tài)參數(shù)的均值反映了細(xì)胞核的大小，DNA含量則反映了腫瘤細(xì)胞的增殖特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察了使用IL-4、紫杉醇后腫瘤細(xì)胞核形態(tài)、DNA含量5個參數(shù)的改變。結(jié)果顯示各用藥組與對照組參數(shù)值比較，差異均有顯著性。各用藥組之間比較，差異亦均有顯著性，因此腫瘤細(xì)胞核形態(tài)測量和DNA含量測定是判斷腫瘤細(xì)胞增殖的一個重要指標(biāo)。
AgNORs是嗜銀的酸性非組蛋白，也是rDNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白，AgNORs的量主要與NORs內(nèi)rDNA轉(zhuǎn)錄的活動水平，細(xì)胞所處的不同分裂周期以及攜帶NORs染色體的數(shù)量有關(guān)［8］。因此AgNORs的數(shù)量可反映細(xì)胞增殖、分化及癌變過程中細(xì)胞內(nèi)蛋白合成及代謝活動變化，AgNORs計數(shù)對良惡性腫瘤的鑒別已有大量的報道［9］。本實(shí)驗(yàn)從Ⅰ組至Ⅳ組，AgNORs計數(shù)依次減少，各組間差異均有顯著性。但本實(shí)驗(yàn)亦對AgNORs顆粒的大小進(jìn)行了測量，從Ⅰ組至Ⅳ組，反映顆粒大小的幾個參數(shù)如面積、周長、平均直徑均依次增大，且各組間差異有顯著性，而且對照組AgNORs顆粒以彌散型為主，使用抑癌藥后AgNORs顆粒單一型和混合型增多，療效越好，單一型越多。由此可見，AgNORs顆粒的大小與分型對于判斷腫瘤的療效、預(yù)后可能具有重要參考價值，這一發(fā)現(xiàn)在文獻(xiàn)中尚未見報道。
細(xì)胞核形態(tài)參數(shù)反映了細(xì)胞核的大小，DNA含量和AgNORs計數(shù)均反映了腫瘤細(xì)胞增殖特點(diǎn)，它們分別從靜態(tài)和動態(tài)功能方面對Lewis肺癌的生長與分化提供信息，本實(shí)驗(yàn)顯示它們之間有良好的相關(guān)性，腫瘤細(xì)胞核越大，DNA含量越高，AgNORs計數(shù)越多，將三者結(jié)合起來分析Lewis肺癌的增殖情況，可以彌補(bǔ)常規(guī)病理形態(tài)學(xué)檢查的不足，具有較大的實(shí)用價值。
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