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2010
03-29

基因重組相關(guān)的基因型
基因重組相關(guān)的基因型recA（Recombination）功能：recA基因表達(dá)ATP依賴型DNA重組酶，它在λ噬菌體與基因組DNA的溶原重組時(shí)起作用，同時(shí)具有對(duì)DNA放射性損傷的修復(fù)功能。由recA基因的變異所產(chǎn)生的基因型使同源或異源DNA的重組不能進(jìn)行，保持插入DNA的穩(wěn)定性，對(duì)DNA的轉(zhuǎn)化有利。一個(gè)菌株的基因型如果是recA，則說(shuō)明此菌株的表現(xiàn)型是重組缺陷的。recB（Recombination）功能：recB基因表達(dá)ATP依賴型DNase和核酸外切酶V的一個(gè)亞基，對(duì)recA的DNA重組酶
2010
03-24

Northern blot技術(shù)
Northernblot技術(shù)經(jīng)乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進(jìn)行的RNA電泳這一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進(jìn)行電泳，因?yàn)榍罢哂緞?dòng)速率較慢而且需將電泳液時(shí)行循環(huán)以避免電泳過(guò)程中形成過(guò)高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝膠對(duì)RNA進(jìn)行分級(jí)離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。1）在滅菌的微理離心管內(nèi)，混勻下列液體：6mol/L乙二醛5
2010
03-24

植物組織RNA提取
植物組織RNA提取的難點(diǎn)及對(duì)策從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進(jìn)行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫(kù)，RT-PCR及差示分析等分子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。a）*Y（WL從文獻(xiàn)報(bào)道上看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展。一般認(rèn)為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無(wú)法
2010
03-15

復(fù)蘇方法
復(fù)蘇方法1．從液氮罐中取出安剖；有時(shí)因安剖未封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍。3．剪開(kāi)紗布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，凈化臺(tái)上打開(kāi)蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。4．低速離心（500～1000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。5．加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)
2010
03-15

蛋白質(zhì)提取的方法
蛋白質(zhì)提取的方法總匯1、植物組織蛋白質(zhì)提取方法1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質(zhì)提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g這種
2010
03-15

幾種常用轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
幾種常用轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化技術(shù)1）致癌化學(xué)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞：轉(zhuǎn)化敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1．取材：妊娠后第13天取材，取數(shù)個(gè)同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無(wú)菌條件下剪碎至米粒大小，再用0.25％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）37℃消化30分鐘，濾過(guò)、低速離心、吸除消化液、加入營(yíng)養(yǎng)液、制備成細(xì)胞懸液、接種入75cm/培養(yǎng)瓶中，接種密度10～20×106/75cm，37℃培養(yǎng)2～3天，在順利情況下能迅速長(zhǎng)滿瓶面。2．貯存：選大批生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存，儲(chǔ)以備用。3．致癌物處理：取凍存細(xì)胞，解凍，接種于25ml培養(yǎng)瓶
2010
03-10

如何提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度
如何提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度：1、分離高質(zhì)量RNA成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。2、使用無(wú)RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與DNA引
2010
03-08

影響質(zhì)粒提取的因素
影響質(zhì)粒提取的因素：質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。宿主菌種類質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖類，如果沒(méi)有*去除，將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。另外，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性
2010
03-08

質(zhì)粒提取原理及流程
質(zhì)粒提取原理及流程：較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（15kb）。堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分
2010
03-08

質(zhì)粒DNA分離和純化
質(zhì)粒DNA分離和純化：純化要求質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶劑分子或過(guò)高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的要求不同，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（如酶切、測(cè)序等）普通純度的質(zhì)粒即可滿足實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無(wú)內(nèi)毒素）?？梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求。純化方法用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來(lái)代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩
2010
02-27

Lowry法蛋白濃度測(cè)定
Lowry法蛋白濃度測(cè)定目錄號(hào)規(guī)格價(jià)格PC0030-10001000T280.00產(chǎn)品簡(jiǎn)介：Lowry法包括兩步反應(yīng)：*步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。定量范圍為5～100μg/ml蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。Lowry法測(cè)定較為不受脂類物質(zhì)干擾，適
2010
02-27

BCA蛋白濃度測(cè)定
BCA蛋白濃度測(cè)定目錄號(hào)規(guī)格價(jià)格PC0020-500500T280.00產(chǎn)品簡(jiǎn)介：Bicinchoninicacid（BCA）法是在世界上常用的蛋白濃度檢驗(yàn)方法之一BCA法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+。兩分子BCA與一個(gè)Cu+螯合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱
2010
02-27

Bradford蛋白濃度測(cè)定
Bradford蛋白濃度測(cè)定目錄號(hào)規(guī)格價(jià)格PC0010-25002500T150.00產(chǎn)品簡(jiǎn)介：Bradford法是常用的蛋白質(zhì)快速定量方法。CoomassiebrilliantblueG-250與蛋白質(zhì)結(jié)合使染料的大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)樘m色，595nm波長(zhǎng)下吸光度值與蛋白含量成正比。靈敏度比Lowry法高4倍，與BCA法相當(dāng)。反應(yīng)迅速，2分鐘即可達(dá)到平衡并在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。操作簡(jiǎn)便，只需要一種反應(yīng)試劑。干擾物質(zhì)少，鈉鉀鎂離子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、巰
2010
02-27

蛋白電泳（PAGE）
蛋白電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺（簡(jiǎn)稱TEMED）和催化劑過(guò)硫酸銨（簡(jiǎn)稱AP）或核黃素（即vitaminB2）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE）SDS－PAGE是在要電泳的樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇（或者DTT）的樣品處理液，SDS可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的
2010
02-04

基因組DNA提取的原則
基因組DNA提取的原則1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（因?yàn)檫z傳信息全部?jī)?chǔ)存在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)）。2、排除其它分子（如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機(jī)溶劑等）的污染，使下游試驗(yàn)順利進(jìn)行。
2010
02-02

胍鹽/β-巰基乙醇法
胍鹽/β-巰基乙醇法適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料。在這種方法中，胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制RNase的活性，保護(hù)RNA不被降解。
2010
02-02

異硫氰酸胍/苯酚法
異硫氰酸胍/苯酚法異硫氰酸胍/苯酚法是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，而蛋白質(zhì)和DNA仍留在有機(jī)相，從而可以完成RNA的提取工作。Solarbio公司的Trizol和總RNA提取試劑盒就是基于異硫氰酸胍/苯酚法開(kāi)發(fā)的一種總RNA提取試劑和試劑盒。Trizol法應(yīng)用非常廣泛，適用于包括動(dòng)物組織、微生物材料、培養(yǎng)細(xì)胞
2010
02-02

DNA的儲(chǔ)存
DNA的儲(chǔ)存儲(chǔ)存溶液：DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩(wěn)定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分為：10mMTris-HCl（Tris與鹽酸形成強(qiáng)的緩沖對(duì)）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二價(jià)金屬陽(yáng)離子，抑制DNase的活性）；pH8.0（堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲(chǔ)存液，但有些實(shí)驗(yàn)室制備的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間保存的DNA容易發(fā)生降解。因此建議用TE作為D
2010
01-26

RNA純化及獲得
RNA純化及獲得純化要求RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。純化方法及沉淀1、有機(jī)溶劑抽提法氯仿抽提：在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時(shí)，常使用氯仿進(jìn)行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從而達(dá)到純化RNA的目的。沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來(lái)沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，
2010
01-26

RNA評(píng)價(jià)與鑒定
RNA評(píng)價(jià)與鑒定提取得到RNA溶液后，我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)，以確定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整且無(wú)酶等抑制物殘留；Northernblot實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法純化RNA，以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果。RNA得率檢測(cè)——分光光度計(jì)法RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織RNA

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