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PCR反應特異性決定因素與提高方法2023/12/18

PCR反應特異性主要決定因素：1引物。引物的結構和長度是PCR特異性的關鍵。此外，引物濃度過高會增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性。2、復性溫度。在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。3、延伸時間。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。4、Mg2+濃度。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過高時，容易出現非特異性擴增，使反應特異性降低。5、DNA聚合酶的種類和數量。不同種類的酶對PCR特異性的影響程度

穩(wěn)轉細胞株篩選與構建2023/12/11

穩(wěn)定細胞株是一種常用于基因表達、藥物篩選和蛋白質表達等領域的工具。但是，穩(wěn)定細胞株的篩選需要經過一系列的步驟和實驗，下面介紹一下穩(wěn)定細胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細胞株的篩選簡要步驟：一、質粒轉染法先把質粒整合到染色體上后，用相應的質粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細胞株。1、篩選濃度測定，以10~14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；2、進行細胞接種，轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋；3、

ELISA試驗結果出現灰區(qū)解析2023/12/04

酶聯免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。它是應用最多的一種免疫酶技術。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數據進行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據為判斷結果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內之外的測定結果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"?！盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計學方法確定。測定結果處于“灰區(qū)"的樣

實驗室血清的應用與保存2023/11/28

血清是由血漿去除纖維蛋白原而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清是血漿中不含纖維蛋白原的膠狀液體,具有維持血液的正常粘度、酸堿度、滲透壓等作用。實驗室準確的應用及保存血清，才能使血清施展應有的效果；現來了解實驗室血清的應用與保存：1.應用前處理:大部分血清在應用前必需滅活處置，即560C30分鐘。滅活的目標是去除血清中的補體身分，防止補體對細胞發(fā)生毒性同化。血清顛末滅活也會喪失一些對細胞

蛋白濃度測定三種常見方法操作要點2023/11/20

一、酪安酸差色光譜法：1.打開分光光度劑，預熱30分鐘，是紫外燈處于穩(wěn)定發(fā)光狀態(tài)2.在2容積為1mlde微量石英比色杯中分別加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸緩沖液，把盛有PH12.0緩沖液的比色杯放入樣品杯中放入支架上，把盛有PH7.4緩沖液的比色杯放入到參比杯的支架上，然后準確的測出295nm波長下的光吸收值，或用250－350nm掃描3.在上述的2個比色杯中分別加入100UL的待測樣品液，小心振蕩混勻4.重復2操作5.計算蛋白濃度：﹝(PH為12.0A295-PH

細胞培養(yǎng)實驗過程及注意事項2023/11/13

細胞培養(yǎng)實驗過程：1、準備工作準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試等。2、取材在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低

細胞凋亡一般階段分析2023/11/06

細胞凋亡（apoptosis）是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內在遺傳機制控制，按照自身程序主動性、生理性的死亡過程。細胞凋亡受凋亡相關基因調控，故又稱為程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學和生物化學特征。在形態(tài)上，可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內

IHC實驗切片染色后背景太深現象的原因2023/10/30

免疫組織化學（IHC）是利用抗原抗體的特異性結合反應來檢測和定位組織和細胞中的某些化學物質的一門技術。全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織陽性那些組織是陰性。切片染色后背景太深，出現特異性與非特異性著色。出現這種現象的原因有：1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。2、抗體孵育時間過長或

PCR反應開始前的準備工作與操作步驟2023/10/23

PCR反應開始前的準備工作：PCR反應開始前，你需要準備好DNA模板（基因組DNA或者反轉錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據實驗的目的不同做出決定）。1、DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇自己實驗需要的產品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到沒有任何突變的PCR產物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Ta

PCR反應結果問題分析研究2023/10/16

聚合酶鏈式PCR反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量，④PCR循環(huán)條件。PCR反應出現假陰性，不出現擴增條帶原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。一、模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處

ELISA試驗包被抗體抗原選取敘述2023/10/08

ELISA試劑盒包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定?？贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20u

校準品、標準品和質控品使用闡明2023/10/03

校準品、標準品、質控品三者同為參考物質。參考物質是一種材料或者物質，某一種或多種特性值只夠均勻并被良好確定，用于校準測量系統(tǒng)，評價測量程序或為材料賦值。但三者并非用一個概念，他們有各自不同的應用場合。臨床上常常有很多錯誤的應用，例如將不同廠商的校準品應用于檢測系統(tǒng)；使用給定值的質控品評價檢測系統(tǒng)；使用質控品來校準檢測系統(tǒng)等等。校準品、標準品、質控品的來源及定值方式，得出正確使用三種參考物質的方法。1、傳統(tǒng)的方法的缺點傳統(tǒng)的檢驗項目，要使得檢驗結果可靠或者有依據，往往會使用一個已知濃度的標準品同樣

分享細胞復蘇傳代與凍存注意事項2023/09/25

1、細胞復蘇將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEMwan全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10mlDMEMwan全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、細胞傳代細胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEMwan全

核酸、抗原及抗體檢測PCR技術探究2023/09/22

PCR技術從原本的實驗室走向大眾視野。伴隨著疫情狀況的不斷改變，核酸檢測這種技術逐漸為大眾所熟知，再一次被大眾知道的，是抗原檢測。但是這些檢測方法到底是檢測什么，又有什么聯系和區(qū)別呢？在搞清楚這幾種檢測方法之前，我們要先搞清楚病毒的結構。病毒基本是由核酸和外層的蛋白質外殼構成。核酸就是DNA或者RNA，是病毒的遺傳物質，外部蛋白質外殼又叫衣殼，起到保護核酸和作為抗原引起免疫的作用。核酸檢測作為最早被大眾熟知的檢測方法，核酸檢測即是通過PCR方法擴增病毒的RNA對應的DNA序列，在擴增體系中加入特

細胞凍存?實驗步驟及注意事項2023/09/11

隨著溫度降低，細胞內的酶活性會逐漸降低，到-70℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實現長期保存。然而，隨著溫度降低，細胞內外的水分也會“結冰”并形成冰晶，冰晶能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。實驗步驟：1.制備凍存液，凍存液比例：本實

ELISA檢測試劑盒適用范圍及樣品收集2023/09/08

適用范圍：1．適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型；2．可檢測動物類型豐富：人、猴、大鼠、小鼠、兔、豬、犬、牛、綿羊、雞等3．可檢測指標齊全：白介素，干擾素，血管緊張素，肺炎衣原體，趨化因子、生長因子基質金屬蛋白酶、炎癥因子、血管生成素等等指標。樣品收集:1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離

生物消息: 細胞因子共同作用特點2023/08/28

細胞因子(cytokine，CK)是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節(jié)固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長、APSC多能細胞以及損傷組織修復等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。眾多的細胞因子有以下共同的作用特點：1、絕大多數細胞因子為質量小于25kDa的糖蛋白，質量低者如IL-8僅8kDa。多數細胞因子以單體形式存在，少數細胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-β等以雙體

資訊推送：微生物培養(yǎng)基配制和滅菌2023/08/21

微生物培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質的要求也各不相同，加之研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，微生物培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。為了達到特定要求的研究，需要進行培養(yǎng)基配制和滅菌。1.配制溶液向容器內加入所需水量的一部分，按照培養(yǎng)基配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最后補足所需

實時熒光定量PCR系統(tǒng)知識合集2023/08/16

實時熒光定量PCR（quantitativePCR,qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環(huán)產物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現對起始模板的定性及定量分析。1.在qPCR技術中重要的參數指標有哪些？擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進程；溶解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，溶解曲線就會出現單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個峰。熒光域值（threshold）:是在熒光擴增曲線

熒光定量PCR總RNA提取步驟2023/08/07

1、A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1mlTrizol。2、B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mLTrizol。3、C細胞樣品：懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mLTrizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，有兩種處理方法。一種