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PCR反應特異性決定因素與提高方法2023/12/18

PCR反應特異性主要決定因素：1引物。引物的結(jié)構(gòu)和長度是PCR特異性的關(guān)鍵。此外，引物濃度過高會增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性。2、復性溫度。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應的特異性。3、延伸時間。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。4、Mg2+濃度。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過高時，容易出現(xiàn)非特異性擴增，使反應特異性降低。5、DNA聚合酶的種類和數(shù)量。不同種類的酶對PCR特異性的影響程度

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選與構(gòu)建2023/12/11

穩(wěn)定細胞株是一種常用于基因表達、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達等領域的工具。但是，穩(wěn)定細胞株的篩選需要經(jīng)過一系列的步驟和實驗，下面介紹一下穩(wěn)定細胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細胞株的篩選簡要步驟：一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應的質(zhì)粒DNA中的抗性標志來篩選該細胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細胞株。1、篩選濃度測定，以10~14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；2、進行細胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應達到60%~80%覆蓋；3、

ELISA試驗結(jié)果出現(xiàn)灰區(qū)解析2023/12/04

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。它是應用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"。“灰區(qū)"的大小可用統(tǒng)計學方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣

實驗室血清的應用與保存2023/11/28

血清是由血漿去除纖維蛋白原而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清是血漿中不含纖維蛋白原的膠狀液體,具有維持血液的正常粘度、酸堿度、滲透壓等作用。實驗室準確的應用及保存血清，才能使血清施展應有的效果；現(xiàn)來了解實驗室血清的應用與保存：1.應用前處理:大部分血清在應用前必需滅活處置，即560C30分鐘。滅活的目標是去除血清中的補體身分，防止補體對細胞發(fā)生毒性同化。血清顛末滅活也會喪失一些對細胞

蛋白濃度測定三種常見方法操作要點2023/11/20

一、酪安酸差色光譜法：1.打開分光光度劑，預熱30分鐘，是紫外燈處于穩(wěn)定發(fā)光狀態(tài)2.在2容積為1mlde微量石英比色杯中分別加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸緩沖液，把盛有PH12.0緩沖液的比色杯放入樣品杯中放入支架上，把盛有PH7.4緩沖液的比色杯放入到參比杯的支架上，然后準確的測出295nm波長下的光吸收值，或用250－350nm掃描3.在上述的2個比色杯中分別加入100UL的待測樣品液，小心振蕩混勻4.重復2操作5.計算蛋白濃度：﹝(PH為12.0A295-PH

細胞培養(yǎng)實驗過程及注意事項2023/11/13

細胞培養(yǎng)實驗過程：1、準備工作準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。2、取材在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低

細胞凋亡一般階段分析2023/11/06

細胞凋亡（apoptosis）是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機制控制，按照自身程序主動性、生理性的死亡過程。細胞凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控，故又稱為程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學和生物化學特征。在形態(tài)上，可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)

IHC實驗切片染色后背景太深現(xiàn)象的原因2023/10/30

免疫組織化學（IHC）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應來檢測和定位組織和細胞中的某些化學物質(zhì)的一門技術(shù)。全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織陽性那些組織是陰性。切片染色后背景太深，出現(xiàn)特異性與非特異性著色。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。2、抗體孵育時間過長或

PCR反應開始前的準備工作與操作步驟2023/10/23

PCR反應開始前的準備工作：PCR反應開始前，你需要準備好DNA模板（基因組DNA或者反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據(jù)實驗的目的不同做出決定）。1、DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇自己實驗需要的產(chǎn)品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Ta

PCR反應結(jié)果問題分析研究2023/10/16

聚合酶鏈式PCR反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。PCR反應出現(xiàn)假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。一、模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處

ELISA試驗包被抗體抗原選取敘述2023/10/08

ELISA試劑盒包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20u

校準品、標準品和質(zhì)控品使用闡明2023/10/03

校準品、標準品、質(zhì)控品三者同為參考物質(zhì)。參考物質(zhì)是一種材料或者物質(zhì)，某一種或多種特性值只夠均勻并被良好確定，用于校準測量系統(tǒng)，評價測量程序或為材料賦值。但三者并非用一個概念，他們有各自不同的應用場合。臨床上常常有很多錯誤的應用，例如將不同廠商的校準品應用于檢測系統(tǒng)；使用給定值的質(zhì)控品評價檢測系統(tǒng)；使用質(zhì)控品來校準檢測系統(tǒng)等等。校準品、標準品、質(zhì)控品的來源及定值方式，得出正確使用三種參考物質(zhì)的方法。1、傳統(tǒng)的方法的缺點傳統(tǒng)的檢驗項目，要使得檢驗結(jié)果可靠或者有依據(jù)，往往會使用一個已知濃度的標準品同樣

分享細胞復蘇傳代與凍存注意事項2023/09/25

1、細胞復蘇將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEMwan全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10mlDMEMwan全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、細胞傳代細胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEMwan全

核酸、抗原及抗體檢測PCR技術(shù)探究2023/09/22

PCR技術(shù)從原本的實驗室走向大眾視野。伴隨著疫情狀況的不斷改變，核酸檢測這種技術(shù)逐漸為大眾所熟知，再一次被大眾知道的，是抗原檢測。但是這些檢測方法到底是檢測什么，又有什么聯(lián)系和區(qū)別呢？在搞清楚這幾種檢測方法之前，我們要先搞清楚病毒的結(jié)構(gòu)。病毒基本是由核酸和外層的蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成。核酸就是DNA或者RNA，是病毒的遺傳物質(zhì)，外部蛋白質(zhì)外殼又叫衣殼，起到保護核酸和作為抗原引起免疫的作用。核酸檢測作為最早被大眾熟知的檢測方法，核酸檢測即是通過PCR方法擴增病毒的RNA對應的DNA序列，在擴增體系中加入特

細胞凍存?實驗步驟及注意事項2023/09/11

隨著溫度降低，細胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低，到-70℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實現(xiàn)長期保存。然而，隨著溫度降低，細胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰”并形成冰晶，冰晶能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內(nèi)離子濃度，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。實驗步驟：1.制備凍存液，凍存液比例：本實

ELISA檢測試劑盒適用范圍及樣品收集2023/09/08

適用范圍：1．適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型；2．可檢測動物類型豐富：人、猴、大鼠、小鼠、兔、豬、犬、牛、綿羊、雞等3．可檢測指標齊全：白介素，干擾素，血管緊張素，肺炎衣原體，趨化因子、生長因子基質(zhì)金屬蛋白酶、炎癥因子、血管生成素等等指標。樣品收集:1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離

生物消息: 細胞因子共同作用特點2023/08/28

細胞因子(cytokine，CK)是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長、APSC多能細胞以及損傷組織修復等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。眾多的細胞因子有以下共同的作用特點：1、絕大多數(shù)細胞因子為質(zhì)量小于25kDa的糖蛋白，質(zhì)量低者如IL-8僅8kDa。多數(shù)細胞因子以單體形式存在，少數(shù)細胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-β等以雙體

資訊推送：微生物培養(yǎng)基配制和滅菌2023/08/21

微生物培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，微生物培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。為了達到特定要求的研究，需要進行培養(yǎng)基配制和滅菌。1.配制溶液向容器內(nèi)加入所需水量的一部分，按照培養(yǎng)基配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最后補足所需

實時熒光定量PCR系統(tǒng)知識合集2023/08/16

實時熒光定量PCR（quantitativePCR,qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。1.在qPCR技術(shù)中重要的參數(shù)指標有哪些？擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進程；溶解曲線是用來驗證擴增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現(xiàn)至少兩個峰。熒光域值（threshold）:是在熒光擴增曲線

熒光定量PCR總RNA提取步驟2023/08/07

1、A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1mlTrizol。2、B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mLTrizol。3、C細胞樣品：懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mLTrizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，有兩種處理方法。一種