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原代細(xì)胞的提取過程及常見細(xì)胞實驗2024/09/29
原代細(xì)胞是指直接從機體取出的安排或細(xì)胞獲得單個細(xì)胞并在體外進(jìn)行培育的細(xì)胞。這里主要指：安排器官、外周血及胚胎等。由于原代細(xì)胞成長緩慢，繁衍必定的代數(shù)中止成長。所以一般認(rèn)為：培育的原代的1代和傳代到10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培育。原代細(xì)胞的提取的整個操作過程：1.整個操作要在潔凈通風(fēng)的超凈臺下進(jìn)行，所有的器件要高壓消毒。2.依據(jù)BALB/c小鼠的體重，用10ml/kg3%濃度的麻醉；將小鼠置于盛有75%乙醇的燒杯內(nèi)，這一步不只能夠消毒，也能夠讓小鼠體毛浸濕，后續(xù)剃去皮毛的時分不會沾到剪刀或安排
微生物實驗室物理和化學(xué)滅菌方法分述2024/09/23
微生物實驗室是進(jìn)行微生物研究的場所，對環(huán)境要求很高，應(yīng)該保證實驗室內(nèi)的環(huán)境潔凈安全，嚴(yán)格的消毒滅菌工作非常重要，影響著實驗室順利研究實驗的順利進(jìn)行，同時嚴(yán)格的消毒滅菌也為實驗室工作人員提供一個清潔而良好的工作環(huán)境。目前，常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如，干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法兩大類。1.干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內(nèi)120℃-150℃的高熱，并保持90-120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能
抗原抗體反應(yīng)的特點及影響反應(yīng)因素探討2024/09/19
抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。這種反應(yīng)既可在機體內(nèi)進(jìn)行，也可以在機體外進(jìn)行。在機體內(nèi)，當(dāng)免疫細(xì)胞被抗原激活后，由B細(xì)胞分化成熟為漿細(xì)胞后所合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin，Ig），激活補體系統(tǒng)從而解除抗原對機體的損傷?？乖贵w反應(yīng)的主要特點：1、特異性：特定的抗體只能與特定的抗原（肽段/蛋白）結(jié)合，這在WB一抗二抗的種屬及反應(yīng)性的選擇常用到；2、比例性：抗原抗體在整個反應(yīng)中存在一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例
酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）簡述2024/09/14
1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA將抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面，利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及抗體或者抗原上標(biāo)記的酶催化特定底物發(fā)生顯色反應(yīng)，實現(xiàn)目標(biāo)物檢測的免疫分析方法，可測至皮摩爾（pmol）級別。ELISA已成為分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析
ELISA試驗檢測出現(xiàn)灰區(qū)結(jié)果分析2024/09/09
酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"?！盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)重難點解讀2024/09/02
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測。1、模板a．模板質(zhì)量不佳，含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白；模板核酸變性不夠；提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。建議選擇質(zhì)量可靠的提取試劑，重新提取高純度基因組模板；若模板為cDNA，需要檢查逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其所用RNA的純度及完整度。b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制劑。c．
血清實驗過程問題解答2024/08/29
血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白原已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和生長因子使細(xì)胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護作用。血清實驗過程問題解答：1.血清使用時一定需要滅活么？答：實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)
細(xì)胞株和細(xì)胞系辨別向?qū)?/a>2024/08/19
細(xì)胞系和細(xì)胞株是細(xì)胞生物學(xué)中常用的兩個概念，它們在研究細(xì)胞的生理、生化、遺傳和分子生物學(xué)等方面起到了重要的作用。盡管兩者相似，但實際上有明顯的區(qū)別。先來看看細(xì)胞系（cellline）的定義。細(xì)胞系是指從原始組織或細(xì)胞中通過培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)等方法獲得的由同一種細(xì)胞組成的細(xì)胞群體。簡單來說，細(xì)胞系是通過將原始細(xì)胞進(jìn)行一系列培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程，使其能夠持續(xù)增殖并具有某些特定的性質(zhì)或表達(dá)某些特定的基因。與細(xì)胞系相對應(yīng)的是細(xì)胞株（cellstrain）。細(xì)胞株是指從細(xì)胞系中分離出的一部分細(xì)胞，這些細(xì)胞具有類
劃痕實驗（細(xì)胞遷移）的實驗流程詳述2024/08/12
細(xì)胞遷移(Cellmigration)：因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Woundhealingassay)，是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。它是一種廣泛建立的研究體外集體細(xì)胞遷移的技術(shù)。。細(xì)胞劃痕（WoundHealing)是一種操作簡單，經(jīng)濟實惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法?；驹恚涸谌诤系膯螌蛹?xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合，于細(xì)胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測
實時熒光定量PCR 引物二聚體相關(guān)問題解答2024/08/05
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能強大的技術(shù)之一。實時熒光定量PCR是在標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成，常用于定量樣本中的DNA或RNA。利用熒光探針或熒光DNA結(jié)合染料，采用實時熒光定量PCR儀檢測熒光并完成PCR反應(yīng)所需的熱循環(huán)，實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的定量。利用序列特異性引物，可測定特定的DNA或RNA序列的拷貝數(shù)。通過檢測PCR循環(huán)的每個階段中擴增產(chǎn)物的量，實現(xiàn)定量。如果樣本中存在高豐度的特定序列(DNA或RNA)，則在早期循環(huán)中即可觀察到擴增；如果序列較少，則在晚期循環(huán)中方可觀察到擴增。
ELISA試驗手工洗滌操作解讀2024/07/30
洗滌在ELISA試驗過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA試驗就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA試驗操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。手工洗板人為因素比較大，實驗人員必須經(jīng)驗豐富，洗滌次數(shù)要足夠，沖擊力又不要太大，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限，
合成培養(yǎng)基的主要成分及配制步驟2024/07/22
細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基)，按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。一、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)：1、氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需
ELISA實驗樣本稀釋技術(shù)全面闡述2024/07/15
一個準(zhǔn)確的ELISA檢測實驗，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實驗操作，三者缺一不可。在操作過程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問題，需要進(jìn)行樣本稀釋。一、在ELISA實驗過程中，超過試劑盒檢測范圍的，一般有這幾種情況。樣本值高的可能情況:1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNF
了解細(xì)胞冷凍過程必看要點匯總2024/07/08
一個實驗室得到一個新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。細(xì)胞冷凍過程有四個要點：細(xì)胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。1、細(xì)胞的收獲用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿90%的時候，這時細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前24小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存
揭秘ELISA試驗出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象原因2024/07/01
酶聯(lián)免疫吸附試驗(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)于1971年分別由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者報道，開創(chuàng)了運用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測定的實驗方法。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會給實驗者判讀結(jié)果帶來
抗體特異性選擇參考的幾個方面2024/06/24
抗體(antibody)免疫細(xì)胞分泌免疫物質(zhì)，是哺乳動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對抗病原體的核心，它是在病原體刺激下由漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）所分泌的一種免疫球蛋白，能夠識別并結(jié)合特異的病原體抗原，隨后通過介導(dǎo)中和作用、調(diào)理作用、效應(yīng)T細(xì)胞殺傷等來清除病原體。隨著抗體制備與改造技術(shù)的飛速發(fā)展，抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域，包括科學(xué)研究、診斷、治療等。特異性（specificity）的本質(zhì)含義是“Connectedwithoneparticularthingonly"即只與唯yi的特定事物相關(guān)，具有專一性
探究ELISA試驗出現(xiàn)灰區(qū)結(jié)果原由2024/06/12
酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"?！盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣
原代細(xì)胞培養(yǎng)基本流程2024/05/27
原代細(xì)胞可用來轉(zhuǎn)染siRNA、antisenseRNA、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。目前，無論國外還是國內(nèi)，原代細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)染都是個熱點難題，市場還缺乏真正有效的商品化的原代細(xì)胞核酸轉(zhuǎn)染試劑。原代細(xì)胞能夠高效轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞，獲得比較理想的基因敲除效果。甚至對一些活體寄生蟲幼蟲，也能獲得較為理想的轉(zhuǎn)染結(jié)果。對于大多數(shù)原代細(xì)胞，RFectPM細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率都在80%以上，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。原代細(xì)胞培養(yǎng)基本流程：1、器官和組織的選擇盡
設(shè)計qPCR引物注意事項2024/05/20
qPCR實驗中，引物設(shè)計也是非常重要的一個環(huán)節(jié)，引物的合適與否與擴增效率是否達(dá)標(biāo)、擴增產(chǎn)物是否特異、實驗結(jié)果是否可用等息息相關(guān)。設(shè)計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：引物盡量要跨內(nèi)含子設(shè)計、產(chǎn)物長度100~300bp、Tm值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近、引物末端最好是G或C等等。1.引物跨內(nèi)含子設(shè)計在設(shè)計qPCR引物時，選擇跨內(nèi)含子設(shè)計的引物可以使gDNA模板不能得到擴增，產(chǎn)物均來源于cDNA的擴增，這樣也就去除了gDNA污染造成的影響。2.引物長度引物長度一般在18~30nt之間，擴增
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）實驗步驟及注意事項2024/05/20
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。實驗步驟：一、總RNA的提取按照總RNA提取實驗步驟提取組織或細(xì)胞中的總RNA。二、cDNA第一鏈的合成目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以
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