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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實驗步驟2024/09/29
實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是一種用于實時擴(kuò)增和檢測特定DNA或RNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針,當(dāng)與擴(kuò)增的DNA或RNA分子結(jié)合時會發(fā)出信號,從而可以對目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。RT-qPCR原理的三個主要步驟:1反轉(zhuǎn)錄:使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。2PCR擴(kuò)增:使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這些
對照品與標(biāo)準(zhǔn)品對比講解2024/09/23
對照品和標(biāo)準(zhǔn)品一樣是指國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中用于鑒別、檢查、含量測定、雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)檢查等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),它是國家藥品標(biāo)準(zhǔn)不可分割的組成部分。國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)基礎(chǔ),它是用來檢查藥品質(zhì)量的一種特殊的專用量具;是測量藥品質(zhì)量的基準(zhǔn);也是作為校正測試儀器與方法的物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。在藥品檢驗中,它是確定藥品真?zhèn)蝺?yōu)劣的對照,是控制藥品質(zhì)量必須用的工具。一、概念:對照品與標(biāo)準(zhǔn)品是2個不同的概念,中國藥典凡例中已有明確的定義:文獻(xiàn)中常將2種概念混淆,認(rèn)為對照品就是標(biāo)準(zhǔn)品,是1種物質(zhì)2種提法而已,造成錯誤的原因,
RNA/DNA提取操作過程重難點(diǎn)匯總2024/09/19
RNA和DNA對大家來說都非常熟悉,其本質(zhì)都是核酸(一種由碳?xì)溲醯自亟M成的化合物),只是在結(jié)構(gòu)組成上有所不同,但是它們的基本組成單位都是核糖、磷酸和堿基。RNA中文叫核糖核酸,英文RibonucleicAcid,與DNA相比,RNA的核糖比DNA多一個氧,因此DNA也稱為脫氧核糖核酸,再者就是兩者的堿基不同,RNA四種堿基主要是A/G/C/U,DNA是A/T/C/G。DNA的主要功能是記錄遺傳信息,而RNA主要功能是轉(zhuǎn)錄和翻譯DNA的遺傳信息,其實RNA還有其他的一些功能,比如RNA是很多病
細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)過程出現(xiàn)問題解答2024/09/14
細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù),在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個生物工程技術(shù),還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說,細(xì)胞培養(yǎng)都是一個重要的過程,細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)??寺 <?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞,這是克隆技術(shù)關(guān)鍵的環(huán)節(jié),而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重
ELISA試驗定性測定方法分析2024/09/09
ELISA定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答,分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果,即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度,其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中,將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗,呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低,可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱,這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中,陽性孔呈色深于陰性孔。在
實時熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)2024/09/02
實時熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction,Real-timeqPCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通常我們會重點(diǎn)關(guān)注Ct值(Cyclethreshold,Ct),其含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。其原理如下:1、TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增
細(xì)胞株和細(xì)胞系對比闡述2024/08/29
細(xì)胞株(cellstrain)是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。一般認(rèn)為,細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法,由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。細(xì)胞系(cellline)是原代細(xì)胞經(jīng)傳代成功后即為細(xì)胞系。泛指一般可能傳代的細(xì)胞。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系,不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代,或傳代
核酸檢測試劑盒PCR實驗使用方法步驟2024/08/19
核酸檢測試劑盒PCR實驗使用方法步驟:使用方法:一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)1.注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。2.標(biāo)記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。3.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。4.在7號管中加入5μ
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理使用條例小結(jié)2024/08/12
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般是指一種確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料,作為分析測量行業(yè)中的“量具',在校準(zhǔn)測量儀器和裝置、評價測量分析方法、測量物質(zhì)或材料特性值和考核分析人員的操作技術(shù)水平,以及在過程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域起著*的作用。企業(yè)或?qū)嶒炇覒?yīng)當(dāng)建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的科學(xué)管理制度,以保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)全流程的可追溯性、使信息傳遞正確有效,保證流轉(zhuǎn)過程數(shù)量和貯存準(zhǔn)確、讓使用更規(guī)范與合理。一、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來源合法,可追溯對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料選擇、制備方法、標(biāo)定方法、標(biāo)定結(jié)果、定值準(zhǔn)確性、量值溯源、穩(wěn)定性等過程進(jìn)行
ELISA酶聯(lián)接免疫吸附劑測定基本類型簡述2024/08/05
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分類及其基本要求2024/07/30
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定義:為了保證分析測試結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確度,并具有可比性和一致性,常常需要一種用來校準(zhǔn)儀器、標(biāo)定溶液濃度和評價分析方法的物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料,作為分析測量行業(yè)中的“量具",在校準(zhǔn)測量儀器和裝置、評價測量分析方法、測量物質(zhì)或材料特性值和考核分析人員的操作技術(shù)水平,以及在過程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域起著重要的作用。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性,通常把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1.一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):主要用于標(biāo)定比它低一級的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、校準(zhǔn)高準(zhǔn)確度的計量
免疫熒光技術(shù)具體操作過程陳述2024/07/22
免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織,否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防
細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基探討2024/07/16
細(xì)胞培養(yǎng),是人工創(chuàng)造與體內(nèi)生長相似的環(huán)境,使細(xì)胞生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。培養(yǎng)基是一切體外培養(yǎng)的基礎(chǔ),為細(xì)胞的生長和代謝活動提供了各種必需的營養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞培養(yǎng)中,培養(yǎng)基是非常重要的因素之一。不同種類的細(xì)胞需要不同的培養(yǎng)基,因此選擇合適的培養(yǎng)基對于細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。下文將詳細(xì)介紹細(xì)胞培養(yǎng)中使用的不同類型的培養(yǎng)基以及其組成成分,以便您選擇適合您研究對象的培養(yǎng)基。一、DMEM培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基是常用的培養(yǎng)基之一,它含有大量必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),適用于培養(yǎng)各種類型的
PCR試劑盒實驗?zāi)0搴怂岬奶崛≈苽湓斒?/a>2024/07/08
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計,酶的質(zhì)量。模板的制備,在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基本技能,決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的產(chǎn)量。傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組份,溶解細(xì)胞膜,使蛋白質(zhì)變性,再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì),尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),再用酚:抽提,然后用
ELISA實驗出現(xiàn)灰區(qū)結(jié)果分析2024/07/01
酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"?!盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣
ELISA檢測各方法一般操作過程2024/06/24
ELISA檢測是一種免疫檢測方法,通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原,包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣,它們依靠抗體與目標(biāo)的結(jié)合來促進(jìn)檢測。通常情況下,ELISA檢測是在96孔板中進(jìn)行的,這種形式使其適合于一次篩選許多樣品。血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液都是用于這些檢測的常見樣品類型,但理論上大多數(shù)液體樣品類型都可以使用。然而,重要的是要考慮到一些樣品類型可能包括抑制性因素,如共享相似抗原表位的緩沖液成分或可能損害目標(biāo)或檢測成分的蛋白酶等因素,這些因素可能
酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒試驗干貨分享2024/06/12
酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒試驗指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。一、樣本處理及要求:1.血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。2.血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。3.尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(200
實驗室樣品處理的常用方法小結(jié)2024/06/03
樣品中往往含有一定的雜質(zhì)或其他干擾分析的成分,影響分析結(jié)果的正確性,所以在分析檢驗前,應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)特點(diǎn)、分析方法的原理和特點(diǎn),以及被測物和干擾物的性質(zhì)差異,使用不同的方法,把被測物與干擾物分離,或使干擾物分離除去,從而使分析測定得到理想的結(jié)果。樣品處理的常用方法有:1、溶劑萃取法:其原理是利用被測物與干擾物溶解性的不同將它們分開。如棒曲霉毒素的測定,常用有機(jī)溶劑抽提棒曲霉毒素,然后再用高效液相色譜法測定。此法操作簡單、分離效果好,但萃取劑常易揮發(fā)、易燃、易爆且具有毒性,所以操作時應(yīng)加以注意。
細(xì)胞周期檢測實驗具體操作說明2024/05/27
細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程,分為間期與分裂期兩個階段。如下圖:G0期:這一期的細(xì)胞稱為休眠細(xì)胞,細(xì)胞暫時脫離分裂周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開始DNA合成,進(jìn)行細(xì)胞分裂。G1期:主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。S期:這個時期主要合成DNA,同時還會合成組蛋白,DNA復(fù)制所需的酶都在這一時期合成。G2期:DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì),包括微絲微管蛋白。M期:RNA合成停止,蛋白質(zhì)合成減
探針設(shè)計的原則具體指什么2024/05/20
探針設(shè)計的原則具體體現(xiàn)如下:1.先選擇好探針,然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。2.所選序列應(yīng)該高度特異,盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率,而且還會阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)檢測,如果不能避免二級結(jié)構(gòu),那么就要相應(yīng)提高退火溫度。3.擴(kuò)增長度應(yīng)不超過400bp,理想的擴(kuò)增長度在100-150bp內(nèi),擴(kuò)增片段越短,有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。4.保持GC含量在20%和80%之間,GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng),從而會導(dǎo)致擴(kuò)
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