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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實驗步驟2024/09/29

實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是一種用于實時擴增和檢測特定DNA或RNA序列的分子生物學技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的DNA或RNA分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。RT-qPCR原理的三個主要步驟：1反轉(zhuǎn)錄：使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。2PCR擴增：使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些

對照品與標準品對比講解2024/09/23

對照品和標準品一樣是指國家藥品標準中用于鑒別、檢查、含量測定、雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)檢查等標準物質(zhì)，它是國家藥品標準不可分割的組成部分。國家藥品標準物質(zhì)是國家藥品標準的物質(zhì)基礎(chǔ)，它是用來檢查藥品質(zhì)量的一種特殊的專用量具;是測量藥品質(zhì)量的基準;也是作為校正測試儀器與方法的物質(zhì)標準。在藥品檢驗中，它是確定藥品真?zhèn)蝺?yōu)劣的對照，是控制藥品質(zhì)量必須用的工具。一、概念：對照品與標準品是2個不同的概念，中國藥典凡例中已有明確的定義:文獻中常將2種概念混淆，認為對照品就是標準品，是1種物質(zhì)2種提法而已，造成錯誤的原因，

RNA/DNA提取操作過程重難點匯總2024/09/19

RNA和DNA對大家來說都非常熟悉，其本質(zhì)都是核酸（一種由碳氫氧氮磷元素組成的化合物），只是在結(jié)構(gòu)組成上有所不同，但是它們的基本組成單位都是核糖、磷酸和堿基。RNA中文叫核糖核酸，英文RibonucleicAcid，與DNA相比，RNA的核糖比DNA多一個氧，因此DNA也稱為脫氧核糖核酸，再者就是兩者的堿基不同，RNA四種堿基主要是A/G/C/U，DNA是A/T/C/G。DNA的主要功能是記錄遺傳信息，而RNA主要功能是轉(zhuǎn)錄和翻譯DNA的遺傳信息，其實RNA還有其他的一些功能，比如RNA是很多病

細胞培養(yǎng)（cell culture）過程出現(xiàn)問題解答2024/09/14

細胞培養(yǎng)（cellculture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細胞培養(yǎng)都是一個重要的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆。細胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中重

ELISA試驗定性測定方法分析2024/09/09

ELISA定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在

實時熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)2024/09/02

實時熒光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，Real-timeqPCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通常我們會重點關(guān)注Ct值（Cyclethreshold，Ct），其含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。其原理如下：1、TaqMan熒光探針：PCR擴增

細胞株和細胞系對比闡述2024/08/29

細胞株(cellstrain)是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的細胞稱為細胞株。一般認為，細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。細胞系(cellline)是原代細胞經(jīng)傳代成功后即為細胞系。泛指一般可能傳代的細胞。其中能夠連續(xù)傳代的細胞叫做連續(xù)細胞系或無限細胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細胞系。大多數(shù)二倍體細胞為有限細胞系。由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代，或傳代

核酸檢測試劑盒PCR實驗使用方法步驟2024/08/19

核酸檢測試劑盒PCR實驗使用方法步驟：使用方法：一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）1.注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。2.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。3.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。4.在7號管中加入5μ

標準物質(zhì)管理使用條例小結(jié)2024/08/12

標準物質(zhì)一般是指一種確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料，作為分析測量行業(yè)中的“量具'，在校準測量儀器和裝置、評價測量分析方法、測量物質(zhì)或材料特性值和考核分析人員的操作技術(shù)水平，以及在過程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域起著*的作用。企業(yè)或?qū)嶒炇覒?yīng)當建立標準物質(zhì)的科學管理制度，以保證標準物質(zhì)全流程的可追溯性、使信息傳遞正確有效，保證流轉(zhuǎn)過程數(shù)量和貯存準確、讓使用更規(guī)范與合理。一、標準物質(zhì)來源合法，可追溯對標準物質(zhì)的原材料選擇、制備方法、標定方法、標定結(jié)果、定值準確性、量值溯源、穩(wěn)定性等過程進行

ELISA酶聯(lián)接免疫吸附劑測定基本類型簡述2024/08/05

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保

標準物質(zhì)分類及其基本要求2024/07/30

標準物質(zhì)定義：為了保證分析測試結(jié)果具有一定的準確度，并具有可比性和一致性，常常需要一種用來校準儀器、標定溶液濃度和評價分析方法的物質(zhì)。標準物質(zhì)已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料，作為分析測量行業(yè)中的“量具"，在校準測量儀器和裝置、評價測量分析方法、測量物質(zhì)或材料特性值和考核分析人員的操作技術(shù)水平，以及在過程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制等領(lǐng)域起著重要的作用。根據(jù)標準物質(zhì)的特性，通常把標準物質(zhì)分為一級標準物質(zhì)和二級標準物質(zhì)。1.一級標準物質(zhì)：主要用于標定比它低一級的標準物質(zhì)、校準高準確度的計量

免疫熒光技術(shù)具體操作過程陳述2024/07/22

免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防

細胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基探討2024/07/16

細胞培養(yǎng)，是人工創(chuàng)造與體內(nèi)生長相似的環(huán)境，使細胞生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。培養(yǎng)基是一切體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)，為細胞的生長和代謝活動提供了各種必需的營養(yǎng)物質(zhì)。在細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是非常重要的因素之一。不同種類的細胞需要不同的培養(yǎng)基，因此選擇合適的培養(yǎng)基對于細胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。下文將詳細介紹細胞培養(yǎng)中使用的不同類型的培養(yǎng)基以及其組成成分，以便您選擇適合您研究對象的培養(yǎng)基。一、DMEM培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基是常用的培養(yǎng)基之一，它含有大量必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，適用于培養(yǎng)各種類型的

PCR試劑盒實驗?zāi)０搴怂岬奶崛≈苽湓斒?/a>2024/07/08

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用

ELISA實驗出現(xiàn)灰區(qū)結(jié)果分析2024/07/01

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。它是應(yīng)用最多的一種免疫酶技術(shù)。ELISA測定的陽性判斷值,通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析后確定的,其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最di。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑,亦即ELISA測定的“灰區(qū)"?！盎覅^(qū)"的大小可用統(tǒng)計學方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)"的樣

ELISA檢測各方法一般操作過程2024/06/24

ELISA檢測是一種免疫檢測方法，通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣，它們依靠抗體與目標的結(jié)合來促進檢測。通常情況下，ELISA檢測是在96孔板中進行的，這種形式使其適合于一次篩選許多樣品。血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液都是用于這些檢測的常見樣品類型，但理論上大多數(shù)液體樣品類型都可以使用。然而，重要的是要考慮到一些樣品類型可能包括抑制性因素，如共享相似抗原表位的緩沖液成分或可能損害目標或檢測成分的蛋白酶等因素，這些因素可能

酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒試驗干貨分享2024/06/12

酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒試驗指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。一、樣本處理及要求：1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（200

實驗室樣品處理的常用方法小結(jié)2024/06/03

樣品中往往含有一定的雜質(zhì)或其他干擾分析的成分，影響分析結(jié)果的正確性，所以在分析檢驗前，應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)特點、分析方法的原理和特點，以及被測物和干擾物的性質(zhì)差異，使用不同的方法，把被測物與干擾物分離，或使干擾物分離除去，從而使分析測定得到理想的結(jié)果。樣品處理的常用方法有：1、溶劑萃取法：其原理是利用被測物與干擾物溶解性的不同將它們分開。如棒曲霉毒素的測定，常用有機溶劑抽提棒曲霉毒素，然后再用高效液相色譜法測定。此法操作簡單、分離效果好，但萃取劑常易揮發(fā)、易燃、易爆且具有毒性，所以操作時應(yīng)加以注意。

細胞周期檢測實驗具體操作說明2024/05/27

細胞周期是指細胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。如下圖：G0期：這一期的細胞稱為休眠細胞，細胞暫時脫離分裂周期,不進行DNA復(fù)制和分裂。但這些細胞可在某些條件的誘導(dǎo)下可重新開始DNA合成,進行細胞分裂。G1期：主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。S期：這個時期主要合成DNA,同時還會合成組蛋白,DNA復(fù)制所需的酶都在這一時期合成。G2期：DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì),包括微絲微管蛋白。M期：RNA合成停止,蛋白質(zhì)合成減

探針設(shè)計的原則具體指什么2024/05/20

探針設(shè)計的原則具體體現(xiàn)如下：1.先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。2.所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴增片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進行二級結(jié)構(gòu)檢測，如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。3.擴增長度應(yīng)不超過400bp，理想的擴增長度在100-150bp內(nèi)，擴增片段越短，有效的擴增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性。4.保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴