超氧陰離子清除能力試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交鏈或者斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機(jī)體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。

測定原理

AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO₂^－，NO₂^－與對氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，樣品對超氧陰離子的清除能力與 530nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 1mL×1 支，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加4mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣品處理

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后 4℃，10000g 離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

4. 粉劑藥物可配制成相同濃度，比如1mg/mL。

測定操作

注意：空白管只需測定一次。

計(jì)算公式

超氧陰離子清除率 I%=（A對照管- A測定管）÷A對照管×*

注意事項(xiàng)

1. 試劑一4℃可保存2個(gè)月，配制好的試劑二4℃可保存一周，建議實(shí)驗(yàn)前配制，并盡快使用。

2. 樣品處理完后立即進(jìn)行測定，或者低溫保存不超過24小時(shí)。