人角膜內(nèi)皮細胞運輸和保存

發(fā)送復蘇存人角膜內(nèi)皮細胞方式：

（1）存活細胞，收到后應繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

（2）收到細胞后請拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請及時拍照與我們聯(lián)系。

細胞接受后的處理：

1） 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。

2） 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。

3） 棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml新的*培養(yǎng)基。

4） 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。

5） 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系。

細胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備基礎培養(yǎng)基100%；北美胎牛血清5%，添加劑1%；雙抗1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1）選用原代細胞生長狀態(tài)好（90－95％），生長數(shù)量大于5×105進行傳代。

2）吸除原代細胞培養(yǎng)液。用含雙抗的1×PBS（pH7.4）清洗細胞培養(yǎng)瓶2次。

3）3ml細胞消化液加入細胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動，使細胞消化液覆細胞培養(yǎng)瓶底。

注：推薦客戶用鈥HO原代細胞消化液。

4）細胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2分鐘后，在顯微鏡下觀察原代細胞的消化狀態(tài)。

請記?。喝缳N壁細胞逐漸趨于圓形、部分懸浮后，用手指輕輕拍打細胞培養(yǎng)側(cè)部至大部分貼壁細胞懸浮，加入3ml血清終止液，終止細胞消化。每種原代細胞的消化時間是有差異的。

5）吹打培養(yǎng)瓶中懸浮細胞若干次，再吸出細胞懸浮液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘。注：推薦客戶用鈥HO原代細胞培養(yǎng)體系。

6）棄離心管中液體，加入原代細胞培養(yǎng)液重懸細胞。細胞計數(shù)，確定細胞數(shù)量。

7）細胞分瓶后，加入適量原代細胞培養(yǎng)液至細胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時。

下面T25瓶為類；

1，細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。