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IL-1的免疫學測定法2012/06/09

以放射免疫法為例。其原理是利用樣品IL-1與125I標記的IL-1競爭結合吸附在Sepharose4B上的多克隆抗IL-1抗體以測定其含量，該方法可排除其他因子的干擾，還可區(qū)分IL-la和Iblb操作步驟如下：①將純化的抗IL-1抗體結合于Sepharose4B上，然后懸于PBS中；②加一定稀釋度的IL-1待測樣品，置室溫24h；③再加lz51標記IL-1至每個實驗管中，作用24h；④2500r／min離心10min去除上清液，再用蒸餾水洗1次；⑤測上清液、洗液（F）及沉淀（B）中的放射活性，從

氨基轉移反應的定性鑒定2012/06/02

一、實驗目的（1）學習一種鑒定氨基轉移作用的簡便方法及其原理；（2）進一步掌握紙層析的原理和操作技術；（3）了解氨基轉移作用在中間代謝中的意義。二、實驗原理氨基移換酶也稱轉氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換，這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內蛋白質的合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質三類物質代謝的相互、相互轉化上，都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進行轉氨作用時，都由其專一的轉氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉氨酶中，以谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶（簡稱谷

離心技術2012/06/02

離心技術是根據(jù)顆粒在勻迷圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發(fā)展起來的一種分離分析技術。1、用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備用的離心技術，轉速都在每分鐘5000轉以下。2、用于生物、醫(yī)學、化學等實驗室分析研究的，轉速從每分鐘幾千到幾萬轉以上，此類技術的使用目的在于分離和純化樣品，以及對純化樣品的有關性能進行研究?；驹?、離心力Centrifugalforce（F）F=mω2rω：旋轉角速度（弧度／秒）r:旋轉體離旋轉軸的距離（cm）m：顆粒質量2、相對離心力Relativec

幾種常用的蛋白鑒定方法2012/06/02

傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選。目前，所選用的技術包括對于蛋白鑒定的圖象分析、微量測序、進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。1圖象分析技術（Imageanalysis）“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計算機為基礎的數(shù)據(jù)處理，進行定量分析。在一

生化與細胞所等發(fā)現(xiàn)索拉菲尼改善肝纖維化的新機制2012/06/02

2011年5月，學術刊物Hepatology刊登了中科院上海生命科學研究院生化與細胞所丁小燕實驗室的研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)索拉菲尼（sorafenib）改善肝纖維化的新機制。中國是“肝病大國”，肝纖維化作為多種慢性肝病病理發(fā)生過程的重要特征，一直是肝病研究和治療領域所關注的重要課題之一。肝纖維化成因復雜，TGF-b是目前已知zui重要的促肝纖維化因子。肝實質細胞在受到損傷和炎癥時分泌TGF-b，刺激并活化肝星狀細胞，同時誘導肝實質細胞發(fā)生EMT（epithelial-mesenchymaltran

過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物的制備2012/06/02

試劑及配制1.HRP和兔（或羊）抗HRP：抗HRP用HRP免疫兔（或羊）獲得。2.0.075mol/L醋酸鈉-0.15mol/L醋酸銨等量混合液3.0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl4.飽和硫酸銨溶液5.0.01mol/LNaOH操作方法1.取兔（或羊）抗HRP血清5ml，16000r/min離心20min，去沉淀；2.于收集的上清中加入HRP（2mg/ml）溶液1ml，室溫緩慢攪拌1h，同上離心；3.沉淀物用冷生理鹽水洗滌3次，棄上清；4.于沉淀中加入HRP（2mg/ml）溶液4

磷酸鹽緩沖液（PB）的配制2012/06/02

1.A液（0.2M磷酸二氫鈉水溶液）：NaH2PO4?H2O27.6g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000ml。2.B液（0.2M磷酸氫二鈉水溶液）：Na2HPO4?7H2O53.6g（或Na2HPO4?12H2O71.6g或Na2HPO4?2H2O35.6g）加蒸餾水溶解，加水至1000ml。3.不同pH值磷酸鹽緩沖液（PB）緩沖液的配制A液Xml（參照下表）中，加入B液Yml，為0.2MPB。若再加蒸餾水至200ml則成0.1MPB。PHXmlYmlpHXmlYml5.793.56.56.945.

IL-4抗CD23單抗檢測法2012/05/26

IL-4能促進B細胞膜表面CD23分子表達，一些BurkittB淋巴細胞瘤株（如Jijoy細胞）未受刺激時，CD23表達水平很低，經(jīng)IL-4刺激后，CD23的表達呈劑量依賴性增加。用抗CD23單抗間接免疫熒光法染色，可檢測人IL-4活性。（1）將5X105／mL的Jiioy細胞培養(yǎng)于含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。（2）取對數(shù)生長期細胞，用新鮮培養(yǎng)液將細胞配成5X105／mL，接種于24孔板中，lmL／孔。分別加待測標本及標準IL-4（不同稀釋度），并設陰性對照，培養(yǎng)48～72h。（

IL-4的檢測生物學及免疫學方法2012/05/26

1、IL-4與LPS共刺激B細胞分泌IgG1和IgE的測定小鼠B淋巴細胞在LPS刺激下首先分泌IgM和IgG3、IgG2b。當IL-4作用于LPS刺激的B細胞時，IgM、ISC3、IgG2b合成產(chǎn)物明顯減少，而IgE、IgCl合成產(chǎn)物顯著地增加。在細胞培養(yǎng)5-6d后，收獲上清，通過對IgE和IgCl測定，間接了解IL-4的含量。IgE測定用放射免疫法；IgCl含量測定可采用雙抗體ELISA夾心法。2、依賴株CT．4S的增殖試驗CT．4S細胞是依賴于IL-4，對IL-2低反應的CTLL變異株，其增

白介素5（IL-5）的檢測2012/05/19

1．依賴細胞株增殖法IL-5依賴株有CHl2、B13、T88-M和BCLl細胞，其培養(yǎng)條件和操作步驟與用CTLL-2細胞3H-TdR摻人法檢測IL-2類似，推薦細胞濃度和加3H-TdR前后的培養(yǎng)時間見表。各種IL-5依賴細胞株檢測ID5的參考實驗條件細胞株細胞濃度加3H-TdR前培養(yǎng)時間加3H．TdR后培養(yǎng)時間CHl25×l103／mL48h6hB135×104／mL36h12hT88-M5×105／mL24h12hBCL15×105／mL72h6h2．DXS共刺激B細胞增殖法（1）常規(guī)制作B細

白介素5（IL-5）的誘生2012/05/19

IL-5由TH細胞產(chǎn)生，其主要靶細胞是B細胞，兼有促進B細胞生長和分化的雙重功能，亦對T細胞和嗜酸性粒細胞有一定的作用。1．B151K12細胞和2．19T細胞上清B151．K12和2．19T細胞均可自發(fā)分泌IL-5，前者以2×105／ml濃度培養(yǎng)36h，后者以5×1105／mL濃度培養(yǎng)24h，其上清即為含IL-5的標本。2．ConA誘生MB2-1細胞上清MB2—1T細胞系為TH2克隆所得，培養(yǎng)于10％NBS-IMDM培養(yǎng)液中。首先，將MB2-1細胞用Hanks液離心洗一次，用10％NBS-IMD

IL-8的誘生與IL—8的免疫學檢測2012/05/12

IL-8由單核／巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞等多種細胞產(chǎn)生，其主要生物活性是激活中性粒細胞。多用人外周血或臍帶血單個核細胞，也可用體外培養(yǎng)傳代細胞系。LPS、PHA、ConA、IL-i、TNFa均是較理想的刺激劑。1．常規(guī)分離PBMC，洗滌后，調整細胞濃度為5X106／mL。2．加入終濃度為1ug／mL的LPS及10mg／mL的PI-IA，混勻后置37％，5％C02溫箱中培養(yǎng)48h，離心收集上清。3．用HCl將培養(yǎng)上清調為酸性（pI-14．0），經(jīng)SephadexG-75柱分離，收集

中性粒細胞趨化試驗檢測IL-82012/05/12

ID8是中性粒細胞的激活劑和趨化因子；本法通過檢測中性粒細胞的遷移距離來反映IL-8活性。（1）配制2倍濃度的DMEM培養(yǎng)液100mL，其中含20mL的FCS，75mgNaHC03，置48C水浴預溫。（2）配制2％瓊脂糖，水浴中保溫48℃左右時，與上述2XDMEM等量混勻。（3）制片（3mlJ片），室溫凝固后，放4~C30～60min進一步凝固，打孔。（4）分離人外周血中性粒細胞，用DMEM調整細胞濃度為2．5×105／mL，取lOgL細胞懸液加人各組中心孔，上孔分別加10／uL含趨化因子的待檢

B9-11細胞增殖法檢測IL—112012/05/05

通過對B9細胞的反復克隆，篩選出對IL-11高度敏感的B9-11細胞株，可用于IL11的檢測。1．B9-11細胞的克隆①向96孔培養(yǎng)板中每孔加入100uL含5％FCS和100ng／mLrIL-11的PMI-1640培養(yǎng)液；②加B9-11細胞于每孔l、3、9和27個細胞，每一細胞濃度做一板，培養(yǎng)2周，陽性生長孔定期更換培養(yǎng)液和補充rIL-1③取出生長較好孔內細胞，測其對IL-11的敏感度，所需IL-11濃度zui低的細胞克隆為B9-11克隆。2．在96孔板中每孔加50rtl用含5％FCSRPMI-

抗體捕捉生物測定法檢測IL—122012/05/05

IL-12由B細胞產(chǎn)生，由分子量分別為35kD和40kD兩個亞基通過二硫鍵連接而成，其功能為誘導T細胞、NK細胞產(chǎn)生IFN-7；增強T細胞、NK細胞的細胞毒作用，促進激活的T細胞、NK細胞增殖。利用鼠抗人IL-12McAb（可自Roche公司購得）測IL-12濃度。1．用包被緩沖液（pH9．5的碳酸鈉緩沖液）稀釋包被抗體為15ug／mL，在96孔酶標反應板，每孔加100rtl，室溫包被過夜。2．洗滌后加封閉液（含1％BSA的磷酸鹽緩沖液）每孑L2001uL，37℃1h。3．在試管中稀釋IL-12

淋巴母細胞增殖法檢測IL—122012/04/21

本法利用IL-12促進PHA激活的人淋巴母細胞增殖來測定IL-12含量，這是目前定量測定IL-12的方法，操作亦較簡單，但因IL-2、IL-4和IL-7亦可促進PHA激活的淋巴母細胞增殖，故此法不宜用于可能含多種細胞因子標本的測定。1．用*培養(yǎng)液稀釋人或鼠IL-12標準品分別至2ng／mL和4nz／mL，然后進行5倍系列稀釋共3個稀釋度。2．系列稀釋待檢標本，使其IL-12濃度大致處于2—20ng／mL范圍。3．向96孔板加PHA激活的人淋巴母細胞50uL／孔（終濃度2X104／mL）。4．加4

IFN-γ誘生法檢測IL—122012/04/21

其原理為IL-12能激活外周血淋巴細胞（PBL）產(chǎn)生IFN-γ，在一定范圍內誘生的IFN-γ量與IL-12的量呈劑量相關性。1．在96孔培養(yǎng)板中每孔加i00~L106個PBL細胞。2．將待測樣本系列稀釋，分別加入各孔，lOOtuL／孔，并用不同稀釋度的I[,-12標準晶作對照。3．培養(yǎng)18h后，取上清100~tL，測IFN-~活性（方法見本章第三節(jié)）。IL-12的活性單位定義為：能誘導IFN-7zui大產(chǎn)率50％的IL-12量稱為1個IL-12活性單位。尚有LAK殺傷活性法，其原理是IL-12和

自動DNA合成儀的日常維護2012/04/14

1．瓶塞“O”形環(huán)一月檢查一次“O”形環(huán)，zui少1年更換1次。將新的備用“O”形環(huán)與儀器上的相比較，如果在“O”形環(huán)上出現(xiàn)白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，進行清洗。更換“O”形環(huán)的步驟如下：用止血鉗夾住“O”形環(huán)，從槽中取下（或用牙簽鉤下），注意不要損壞托住“O”形環(huán)的白色聚氟乙烯插塞（tefloninsert）；確保插塞上沒有顆粒后，用手指將新“O”形環(huán)推進槽，進行壓力實驗。2．儲液瓶瓶子都要放在亞磷酰胺及儲液瓶位置上，并保持氬氣壓力以及管路清潔。3．流路節(jié)流閥為了防止阻塞，節(jié)流閥應該1個月清洗1

DNA合成儀的發(fā)展2012/04/14

當前DNA合成儀的主要生產(chǎn)廠商都致力于機器性能的完善和應用領域的開拓以及率、高產(chǎn)率的儀器的開發(fā)與研究。中國臺灣科學委員會“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計劃”中的基因生物技術組已經(jīng)成功研發(fā)**臺高密度復制DNA合成儀，可以同時合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應裝置，大量復制各種基因，不但節(jié)省時間，也可節(jié)省大量人力，這部機器能復制動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。由于人們所需要的大部分核酸的堿基對數(shù)量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的zui長核酸鏈的堿基對數(shù)量，因

蛋白質的膠體金標記2012/04/07

當?shù)鞍踪|的zui適穩(wěn)定量及標記的*pH值被確定以后，便可進行標記。具體步驟如下。（1）根據(jù)標記所用膠體金的總量計算出所需要待標記蛋白質的總量。（2）邊攪拌邊將蛋白質溶液加入膠體金溶液中，逐漸加入，lmg的蛋白質量大約需5min，或在攪拌下將膠體金逐漸加入到蛋白質溶液中，大約需5～10min。（3）繼續(xù)攪拌10min，然后加入5％BSA使其終濃度為1％，或加入3％聚乙二醇（PEG，Mr：20000）使其終濃度為0．05％，其效果BSA要優(yōu)于PEG。（4）將標記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放人