超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒       BB-4710

超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒

使用方法：

1、 樣品處理：

① 血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD檢測緩沖液稀釋后檢測。

血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500ul全血，4℃，3000g離心5min。轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測。亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。

②組織樣本：動(dòng)物用含有20U/ml heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500ul SOD檢測緩沖液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，4000g離心10min。取上清液（SOD粗提液）用于酶活性測定。

③細(xì)胞樣本：對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細(xì)胞?？梢允褂眉?xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞收集細(xì)胞。細(xì)胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次。按照10⁶細(xì)胞加入300-500ul SOD檢測緩沖液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000g離心10min，取上清液（SOD粗提液）用于酶活性測定。

④上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100ug蛋白量通常已經(jīng)足夠后續(xù)檢測。

2、NBT/酶工作液的配制：按照每個(gè)反應(yīng)1.6ml的體積，均勻混合1mlSOD檢測緩沖液、0.3ml NBT顯色液、0.3ml酶溶液，即可配置成1.6ml NBT/酶工作液，根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的NBT/酶工作液。

具體配置方法可以參考下表。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。     

注意: 由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后混勻后再使用。

3、 (可選做)準(zhǔn)備SOD標(biāo)準(zhǔn)品：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液

將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測中可以各取20μl，參考樣品進(jìn)行檢測。說明：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用。

4、 參考下表使用小離心管或試管設(shè)置空白對照管、光照對照管、測定管。并按下表依次加

入待測樣品和其它各種溶液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。     

5、 SOD活性檢測：混勻，取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應(yīng)20min，

各管受光情況應(yīng)*，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，低時(shí)延長。反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的空白對照管調(diào)零，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測560nm處吸光度值，如果用分光光度計(jì)，比色杯光徑應(yīng)為1cm，加入的上清量因根據(jù)比色杯的zui小量程而定。

計(jì)算：  

SOD活性單位活力單位的定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位(U)。

液體中總SOD活力(U/ml)=(A_光照－A_測定)×V/(50%×A_光照×V_T)

組織、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=( A_光照－A_測定)×V/(50%×A_光照×V_T×W)

組織、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/gHb)=( A_光照－A_測定)×V×C/(50%×A_光照×V_T×Hb)

相關(guān)產(chǎn)品：