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細(xì)胞培養(yǎng)-培養(yǎng)細(xì)胞的取材2010/03/01: 細(xì)胞培養(yǎng)--培養(yǎng)細(xì)胞的取材人和動(dòng)物體內(nèi)絕大部分組織都可以在體外培養(yǎng)，但其難易程度與組織類型、分化程度、供體的年齡、原代培養(yǎng)方法等有直接關(guān)系，原代取材是進(jìn)行組織培養(yǎng)的*步。取材的基本要求（1）取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4度冰箱中。如果組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過(guò)24h。（2）取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，用無(wú)菌包裝的器皿或用事先消毒好的，帶少許培養(yǎng)液的小瓶等便于攜帶的物品取材，取材過(guò)程中要盡量避免紫外線照射和接觸化學(xué)試

細(xì)胞因子介紹 2010/02/24: 為了維持機(jī)體的生理平衡，抵抗病原微生物的侵襲，防止腫瘤發(fā)生，機(jī)體的許多細(xì)胞，特別是免疫細(xì)胞合成和分泌許多種微量的多肽類因子。它們?cè)诩?xì)胞之間傳遞信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過(guò)程，提高機(jī)體的免疫力，在異常情況下也有可能引起發(fā)燒、炎癥、休克等病理過(guò)程。這樣一大類因子已發(fā)現(xiàn)的有上百種，統(tǒng)稱為細(xì)胞因子，包括淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子、單核細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子、各種生長(zhǎng)因子等。許多細(xì)胞因子是根據(jù)它們的功能命名的，如白細(xì)胞介素（IL）、干擾素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、腫瘤壞死因子（TNF）、紅細(xì)胞生成素（EPO）

磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）2010/02/23: 磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidine

ELISA的操作要點(diǎn)2010/02/01: ELISA的操作要點(diǎn)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn)。本文將敘述板式ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式、管式及磁性球ELSIA，國(guó)外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說(shuō)明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.1標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)

ELISA實(shí)驗(yàn)基本原理2010/01/29: ELISA實(shí)驗(yàn)基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶

無(wú)血清培養(yǎng)基2010/01/28: 無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基（serumfreemedium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。無(wú)血清培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死方法2010/01/27: 緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/LTris-乙酸50×：242gTris堿0.001mol/LEDTA57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸10×:10gTris堿0.002mol/LEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/LTris-硼酸5×：54gTri

分子生物學(xué)常用試劑配置2010/01/27: 分子生物學(xué)常用試劑配置分子生物學(xué)常用試劑配置一、分子生物學(xué)常用貯存液的配制1．30%丙烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用濾器（0.45μm孔徑）過(guò)濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫?！咀⒁狻勘０肪哂泻軓?qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過(guò)皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未

檢測(cè)細(xì)胞凋亡的幾種方法2010/01/25: 檢測(cè)細(xì)胞凋亡的幾種方法一、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測(cè)定凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測(cè)。（一）檢測(cè)步驟1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；2、在微定量板上吸附組蛋白體’3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’4、加酶的底物，測(cè)光吸收制。（二）用途該法敏感性高，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞?？捎糜谌恕⒋笫?、小鼠的凋亡檢測(cè)。該法

Western Blotting的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法2010/01/22: WesternBlotting的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法問(wèn)題出現(xiàn)的原因解決方法1.膠片上存在反轉(zhuǎn)印象（如:亮的條帶.黑的背景）HRP的濃度過(guò)高稀釋HRP至少10倍2.膜上有黃色或棕色的沉積HRP的濃度過(guò)高稀釋HRP至少10倍3.在暗室中條帶過(guò)于明亮HRP的濃度過(guò)高稀釋HRP至少10倍4.條帶的發(fā)光時(shí)間持續(xù)了至少8小時(shí)HRP的濃度過(guò)高稀釋HRP至少10倍5.信號(hào)太弱或沒(méi)有1.太多的HRP積聚導(dǎo)致信號(hào)快速的消退2.抗原或抗體的濃度不夠3.轉(zhuǎn)印不成功4.HRP或其他底物的效價(jià)降低1.稀釋HRP至少10倍2.

陰性結(jié)果常見(jiàn)原因2010/01/22: 陰性結(jié)果常見(jiàn)原因①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序滴加，是否孵育了足夠的時(shí)間。③對(duì)照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測(cè)系統(tǒng)是否和一抗匹配。如，一抗是兔來(lái)源，一定要用抗兔的二抗來(lái)匹配；或一抗是羊來(lái)源，必須用抗羊的二抗來(lái)匹配。④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液是否正確。一抗的稀釋液不能用來(lái)稀釋二抗。⑤檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體。不要與揮發(fā)性有機(jī)溶劑一起保存，以免降低抗體的效價(jià)。要求冷凍保存的抗

蛋白酶的底物特異性（sigma的合成底物）2010/01/20: 蛋白酶的底物特異性（sigma的合成底物）問(wèn)：新篩選的蛋白酶，用sigma合成底物測(cè)其底物特異性，包括lys－pNA,phe－pNA,leu－pNA，ala－nitroanilidehydrochloride，glu－nitroanilide，但都沒(méi)有顯色，就是說(shuō)沒(méi)有酶活。難道對(duì)這些位點(diǎn)都不切割嗎？有沒(méi)有可能有其他原因？合成小肽的長(zhǎng)度對(duì)酶特異性影響大嗎？另外，有一些底物是用dmso溶解的，我的酶不耐有機(jī)溶劑，但底物只占終體積的1/10,dmso會(huì)對(duì)我的酶產(chǎn)生影響嗎？謝謝！答：合成小肽的長(zhǎng)度對(duì)酶活

蛋白酶活性與PH值的關(guān)系 2010/01/20: 蛋白酶活性與PH值的關(guān)系問(wèn)：要抑制蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的酶解作用，我想請(qǐng)教一下，在PH7-8之間蛋白酶的活性能夠被明顯的抑制嘛？因?yàn)镻MSF毒性太大，還有沒(méi)有別的抑制蛋白酶活性的試劑阿？EDTA能夠抑制金屬蛋白酶嘛？是不是跟EDTA螯合了Mg，Ca有關(guān)？答：許多細(xì)胞蛋白酶只有在溶酶體的偏酸性環(huán)境中才具有zui大的活性，將pH調(diào)制中性將有助于使蛋白酶的活性降至zui低，但是仍然不能*消除它的影響，目前zui常用的方法是通過(guò)加入蛋白酶抑制劑控制蛋白酶水解，同時(shí)盡可能在4度下進(jìn)行操作。PMSF毒性確實(shí)很

植物病毒病檢測(cè)方法2010/01/20: 植物病毒病檢測(cè)方法植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種重要病害，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量,目前還沒(méi)有1種治療效果較理想的藥劑，對(duì)發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測(cè)就顯得尤為重要。植物病毒學(xué)歷經(jīng)近百年的發(fā)展，植物病毒的檢測(cè)方法與手段也在不斷發(fā)展與改進(jìn)。常用的方法有侵染力測(cè)定法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡計(jì)數(shù)和分子生物學(xué)法等。1.4.1侵染力測(cè)定法侵染力測(cè)定法是將病毒樣本接種在植物上，根據(jù)侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)一種新的定量法，如果不經(jīng)過(guò)侵染力的驗(yàn)證，將無(wú)法

常用酶的配制2010/01/19: 常用酶的配制1．溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20℃。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。2．蛋白水解酶類貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液溫度預(yù)處理0.01mol/LTris（pH7.8）鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/ml0.01mol/LEDTA37℃自消化b0.5%SDS0.01mol/LTris（pH7.8）蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/ml0.005mol/LEDTA37～56℃無(wú)須預(yù)處理0.5%SDSa：鏈霉蛋白酶是

試劑配制注意事項(xiàng)2010/01/19: 試劑配制不同的培養(yǎng)液在配制的時(shí)候其成分不同，要注意的事項(xiàng)也不同。一、配制首先要保證每種成分都是合格的。1水的質(zhì)量很關(guān)鍵，zui少是三蒸，電阻率在0.1-1.0×10-6Ω?cm以上。2血清等其它營(yíng)養(yǎng)成分注意看是否在保質(zhì)期。二、配制時(shí)各成分是分開(kāi)來(lái)配，用之前混好，一周之內(nèi)用完。2zui基本的成分配好過(guò)濾分裝放置4度。3血清用之前再按比例加入。4抗生素也分裝保存，用之前加入。5如果配方要求加谷氨酰胺，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在

PCR實(shí)驗(yàn)污染與對(duì)策2010/01/19: PCR反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生.一、污染原因1、標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染.2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染

流式細(xì)胞儀2010/01/19: 流式細(xì)胞儀介紹流式細(xì)胞儀就是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進(jìn)的檢測(cè)儀器，被譽(yù)為試驗(yàn)室的“CT”。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytoMeter,FCM）是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代的細(xì)胞定量分析技術(shù)。工作原理將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞

羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序2010/01/19: 羅氏公司TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)程序貨號(hào)：11684817910，InSituCellDeathDetectionKit,POD，價(jià)格：5266.8一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，h

如何保存抗體2010/01/19: 如何保存抗體抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果！如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。請(qǐng)謹(jǐn)記！無(wú)論何時(shí)請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)推薦的保存條件正確保存抗體！1.收到抗體后請(qǐng)務(wù)必在12000rpm離心1-5分鐘后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝和保存（如果抗體體積小于50ul，請(qǐng)延長(zhǎng)離心時(shí)間至5分鐘，以保證全部抗體均離心下來(lái)）！2.比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃or-80℃。對(duì)絕大多數(shù)抗體來(lái)說(shuō)，保存在-20℃是*足夠了。沒(méi)有任何證據(jù)顯示保存在-80℃會(huì)有更多的好處！分裝可以zui大程

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