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酶的提取和分離純化2011/03/28

酶的提取和分離純化（一）細胞破碎處理www.runwelltac.com許多酶都存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。細胞破碎的方法很多，主要包括機械破碎法、物理破碎法、化學(xué)破碎法和酶學(xué)破碎法等。機械破碎法是指利用搗碎機、研磨器或勻漿器等將細胞破碎。物理破碎法是指利用溫度差、壓力差或超聲波等將細胞破碎?；瘜W(xué)破碎法是指利用甲醛、丙酮等有機溶劑或表面活性劑作用于細胞膜，使細胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞或透性發(fā)生改變。酶學(xué)破碎法是指選用合適的酶，使細胞壁遭到破壞，進而在低滲溶液中將原生質(zhì)

聚乙二醇修飾劑及其他衍生物簡介2011/03/21

聚乙二醇修飾劑及其他衍生物簡介一、聚乙二醇修飾劑近年來，蛋白質(zhì)多肽等生物大分子藥物和天然產(chǎn)物藥物分子被越來越多的應(yīng)用于疾病治療領(lǐng)域，極大地推動了醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。然而，生物大分子在藥用過程中的作用卻由于其半衰期短、容易產(chǎn)生免疫原性抗原性、易被酶解、有一定藥理毒性等問題被大大限制。為有效解決該問題，國家生化工程技術(shù)研究中心（北京）研制開發(fā)了一系列聚乙二醇修飾劑，通過對藥物分子進行聚乙二醇化學(xué)修飾來達到延長藥效的目的。因為聚乙二醇鏈的空間阻礙作用使得被修飾蛋白對蛋白酶酶解的抵抗能力大為提高，同時被修飾

聚苯乙烯（PST）特點及應(yīng)用2011/03/17

聚苯乙烯（PST）特點及應(yīng)用1.概述www.runwelltac.com聚苯乙烯－二乙烯基苯微球（polystyrenedivinylbenzenebeads,PST）具有剛性大，耐受有機溶劑性能好，pH值的適用范圍廣等優(yōu)點，是一種非常有應(yīng)用前途的層析介質(zhì)。同多糖型凝膠微球相比較，交聯(lián)聚合物微球的骨架結(jié)構(gòu)具有更高的機械強度和化學(xué)穩(wěn)定性，所以更適合能經(jīng)受高流速高壓力操作的液相色譜使用。中國科學(xué)院過程工程研究所國家生化工程技術(shù)研究中心采用SPG（ShirasuPorousGlass）膜乳化技術(shù)與懸浮

標記的鏈霉卵白素-生物素法2011/03/10

標記的鏈霉卵白素-生物素法www.runwelltac.com標記的鏈霉卵白素-生物素法（LSAB）標記的鏈霉卵白素-生物素法（LSAB法）是標記的卵白素技術(shù)，20世紀80年代開始采用。基本試劑：①*抗體；②生物素化第二抗體；③辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素。實驗方法：1.將固定后的標本用PBS漂洗；2.于室溫下用1%H2O2或1%H2O2甲醇浸泡涂片10~20min，用來密封內(nèi)源性過氧化物酶；3.TBS漂洗3次，每次1min；4.在室溫下用二抗的正常血清孵育20min；5.滴加一抗后在室溫下放

WB實驗的基本原理及操作流程2011/03/02

WB實驗的基本原理及操作流程www.runwelltac.com【實驗原理】一個基因表達*結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)（或酶）。因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達的主要標志，檢測蛋白質(zhì)的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與*抗體共孵。*抗體專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合

如何使用離心機提取植物基因組DNA2011/02/24

如何使用離心機提取植物基因組DNA植物基因組DNA提取使用什么樣的離心機做?具體步驟怎么樣？植物組織提取基因組DNA一、材料www.runwelltac.com幼嫩葉子。二、設(shè)備移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。（這時選擇設(shè)備的時候注意選擇那種通用性強的，可以一機配多種轉(zhuǎn)子的離心機，可以大大的降低設(shè)備采購成本，比如說我廠生產(chǎn)的TG16臺式高速離心機，就有16種轉(zhuǎn)子可供選擇，有6*50ml（角轉(zhuǎn)子），16*

雌激素可抑制病毒感染2011/02/15

雌激素可抑制病毒感染www.runwelltac.com一般人會認為，雌激素與病毒感染是風(fēng)馬牛不相及的問題。然而，美國國立心肺血液學(xué)研究所進行的一項研究表明，雌激素有助于拮抗一種常見病毒——巨細胞病毒，因此可防止心臟細胞遭受炎癥損害。*，病毒可觸發(fā)人體的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生一些活性氧分子，稱為氧自由基，這些物質(zhì)在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中具有重要作用，當斑塊阻塞了血管，便會導(dǎo)致心臟病發(fā)作或心腦卒中發(fā)生。研究人員將體外培養(yǎng)的絕經(jīng)前婦女冠脈平滑肌細胞，預(yù)先用不同分子結(jié)構(gòu)和不同濃度的雌激素處理后，暴露于巨

細胞培養(yǎng)實驗中用到的材料2011/02/10

細胞培養(yǎng)實驗中用到的材料1.種類www.runwelltac.com1.1.細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無菌制品。1.2.TC級培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依實驗需要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料離心管:15ml,50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polyprop

原代細胞核膜的分離2011/01/24

原代細胞核膜的分離試劑和器材www.runwelltac.com：1.DNA酶Ⅰ；2.KCl（1mol/L溶于20mmol/LTris-HCl，pH7.4）；3.MgCl2（1mol/L儲存液）；4.苯甲基磺酰氟（PMSF）（無水乙醇配制的1mol/L儲存液）；5.純化的細胞核；6.緩沖液：2mmol/LTris-HCl，pH7.4；7.膜懸浮緩沖液（ESB）：0.25mol/L蔗糖、2mmol/LTris-HCl，pH7.4；8.梯度溶液：1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、

碘克沙醇梯度溶液分離細胞核2011/01/18

碘克沙醇梯度溶液分離細胞核用碘克沙醇梯度溶液從哺乳動物肝臟中分離細胞核www.elisa17.com試劑和器材：1.OptiPrepTM（600g碘克沙醇，ρ=1.32g/ml）；2.OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTMdiluent，OD）：150mmol/LKCl、30mmol/LMgCl2、120mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8；3.勻漿介質(zhì)（HM）：0.25mol/L蔗糖、25mmol/LKCl、5mmol/LMgCl2、20mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.

檢測抗體設(shè)備購置的注意事項2011/01/14

檢測抗體設(shè)備購置的注意事項抗體是完成免疫組織化學(xué)染色的主要試劑，可將其分為特異性一抗（或稱一級抗體）和第二抗體（或稱二級抗體，也可稱為二抗或標記二抗），尤其特異性一抗更為重要。目前國內(nèi)外市場各種特異性抗體日益增多，銷售公司也很多，大多數(shù)使用者直接選用市售現(xiàn)成商品。www.runwelltac.com抗體質(zhì)量的好壞是完成免疫組化工作的關(guān)鍵，目前可從二條途徑獲得。首先可從市場上獲得商品化抗體，這是主要來源。但有時為了研究或證實一種新的抗原成分，而又無相應(yīng)抗體可購買時，往往需要自己制備抗血清。當然，也

如何解決技術(shù)難題2011/01/11

如何解決技術(shù)難題如何解決技術(shù)難題且看五個科學(xué)實例隨著對細胞生理研究的逐漸深入，科學(xué)家們開始解析單個細胞的行為，這是因為即使是同樣的遺傳物質(zhì)，同樣的周邊環(huán)境，這些細胞還是會朝著不同的方向發(fā)展，有時還會生成不同的功能，而且單個細胞的變化還關(guān)系到癌癥，神經(jīng)疾病等疾病。www.runwelltac.com然而要分析單個細胞，卻不是那么容易的事情，在基因表達分析中占據(jù)主要位置的DNA芯片這種分析方法，由于靈敏度不夠，所以不足以發(fā)現(xiàn)單個細胞水平上的差異，但是從單個細胞中挑選少量RNAs，或者蛋白也不容易做到

細胞培養(yǎng)板的選擇和常見問題2011/01/06

細胞培養(yǎng)板的選擇和常見問題細胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U型和V型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536孔等；根據(jù)材質(zhì)的不同有Terasaki板和普通細胞培養(yǎng)板。具體選擇時根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型、所需培養(yǎng)體積及不同的實驗?zāi)康亩?。www.runwelltac.com（1）平底和圓底（U型和V型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇：貼壁細胞一般用平底培養(yǎng)板。懸浮型細胞的培養(yǎng)一般用V型。U型培養(yǎng)板亦多用于培養(yǎng)懸浮型細胞。V型培養(yǎng)板有時用做免疫學(xué)血凝集的實驗。不同型狀的板子自然有不同

非限制性體干細胞的分離2011/01/04

非限制性體干細胞的分離非限制性體干細胞（USSCs）的分離試劑和材料：1.起始培養(yǎng)基；2.擴增培養(yǎng)基；3.0.05%胰蛋白酶，含EDTA；4.PBSA；5.T25培養(yǎng)瓶；實驗方法：1.制備和分離臍帶血來源的MNCs（CB-MNCs）；2.如果使用凍存的CB-MNCs，復(fù)蘇的細胞可以用于培養(yǎng)，不需要其他分離步驟；3.用起始培養(yǎng)基按5×106—7×106個細胞/ml濃度接種到T25的培養(yǎng)瓶中；4.將細胞放在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，2-4周內(nèi)每周一次更換培養(yǎng)基和細胞因子；5.形成USSC集落后

限制性內(nèi)切酶綜述及分類指南2010/12/31

限制性內(nèi)切酶綜述及分類指南發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶40年前，當人們研究細菌對抗噬菌體宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。人們普通認為，限制性內(nèi)切酶能保護細菌不受噬菌體的感染，行使微生物免疫功能。缺乏限制性內(nèi)切酶的E.coli菌株極易被噬菌體感染，但如果這類細菌體內(nèi)存在限制性內(nèi)切酶，被成功感染的機率就會明顯降低。擁有的限制性內(nèi)切酶種類越多，保護作用也就越強；一種擁有四、五種不同限制性內(nèi)切酶的細胞就幾乎不受感染。*被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoRI和EcoRII，以及來源于流感嗜

胚胎干細胞培養(yǎng)操作規(guī)程2010/12/29

胚胎干細胞培養(yǎng)操作規(guī)程維持ES細胞處于未分化狀態(tài)：ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DM

免疫組化技術(shù)要點和常見問題2010/12/27

免疫組化技術(shù)要點和常見問題在免疫組化過程中，為了更好的說明問題和查找原因，設(shè)置陽性對照片（已知的高表達相應(yīng)抗原的組織）和陰性對照組織片（不加一抗但是加二抗系統(tǒng)/不加任何抗體兩組），所有操作過程應(yīng)*一致。染色弱或者沒有染色（按照先后順序，先排除一些簡單的原因）：試劑使用順序錯誤或者漏加試劑重復(fù)實驗，保證每一步均正確二抗和一抗不匹配選擇匹配的二抗底物和酶不匹配選用匹配的底物酶失活換用新的酶（將酶和底物混合，看是否顯色？）組織中沒有待測抗原表達或者表達水平低使用陽性對照片抗體濃度太低增加抗體濃度.使用

脂肪酸的氧化過程及其概念2010/12/20

脂肪酸的氧化過程及其概念一,脂肪酸的β-氧化過程肝和肌肉是進行脂肪酸氧化zui活躍的組織，其zui主要的氧化形式是β-氧化。此過程可分為活化，轉(zhuǎn)移，β-氧化共三個階段。1.脂肪酸的活化脂肪酸參加代謝前和葡萄糖一樣也先要活化。其活化形式是硫酯——脂肪酰CoA，催化脂肪酸活化的酶是脂酰CoA合成酶（acylCoAsynthetase）?；罨笊傻闹oA極性增強，易溶于水；分子中有高能鍵、性質(zhì)活潑；是酶的特異底物，與酶的親和力大，因此更容易參加反應(yīng)。脂酰CoA合成酶又稱硫激酶，分布在胞漿中、

alamarBlue的用法2010/12/03

alamarBlue的用法貼壁細胞和非貼壁細胞都適用。所有操作在無菌條件下進行。避免污染細胞，因為微生物污染也會還原alamarBlueTM，培養(yǎng)基中應(yīng)添加抗生素如青霉素G（1U/ml）、兩性霉素B（amphotericinB，0.0025ug/ml）。氧化還原指示劑是pH敏感的，推薦使用磷酸緩沖液。10％胎牛血清對比色法檢測無影響，但是會淬滅部分熒光；因此，用熒光法檢測時對照溶液中需添加10％BSA。酚紅對檢測也有一定影響，結(jié)果會上調(diào)0.03%。一般來說，應(yīng)使用非還原性的培養(yǎng)基，如RPMI16

如何選擇熒光二抗2010/11/30

如何選擇熒光二抗如何選擇二抗——根據(jù)一抗種屬及類型選擇合適的二抗二抗廣義上是指專門和一抗進行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，在免疫學(xué)反應(yīng)中，經(jīng)常需要針對試驗選擇不同的二抗，檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，一般來說，選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：【一抗的種屬來源】二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均