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2015
09-18

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)免熱激及孵育的方法
介紹一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)免熱激及孵育的方法。背景：目前外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的步驟，需要先將質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞在冰上撫育半小時(shí)，然后42度熱激90秒，加液體培養(yǎng)基緩搖1個(gè)小時(shí)左右再離心涂板。其中熱激步驟溫度和時(shí)間要求嚴(yán)格，熱激后大量菌細(xì)胞死亡，還要經(jīng)過液體培養(yǎng)基撫育才能涂板。方法改進(jìn)：我們可以在做質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞在冰上撫育的同時(shí)，將要涂的平板放在37度培養(yǎng)箱里，當(dāng)撫育結(jié)束后，立即涂到已經(jīng)加熱到37度的平板上，利用培養(yǎng)板的熱度代替熱激，平板可以直接放回培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。由于溫度相對(duì)溫和，細(xì)胞死亡的少，
2015
09-16

如何預(yù)防及有效控制高血壓
高血壓是我國(guó)居民健康的主要威脅，目前全國(guó)高血壓患者已達(dá)2億人。雖然高血壓被確定為心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素已近50年，但如何預(yù)防及有效控制依然是世界性難題，其主要障礙是95%以上的高血壓為病因不明的原發(fā)性高血壓，因此難以進(jìn)行有效的早期預(yù)防和治療。近日，研究證實(shí)，除遺傳、不良生活方式外，病毒感染或許也是原發(fā)性高血壓的原因之一。這項(xiàng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心楊新春教授、蔡軍副教授課題組完成的研究顯示，巨細(xì)胞病毒感染可能是高血壓的觸發(fā)因素，從而在上提出了高血壓病毒感染學(xué)說。研究人員通過臨床病
2015
09-14

血清/血漿樣本研究的挑戰(zhàn)
大量研究表明，血液循環(huán)中的microRNA表達(dá)變化指征著疾病的發(fā)生和發(fā)展階段。同時(shí)，血液樣品在臨床易于獲取，且穩(wěn)定不易降解，因此對(duì)于microRNA標(biāo)記物篩選具有廣闊研究前景。血清/血漿樣本用于microRNA研究的挑戰(zhàn)?血清血漿中不包含細(xì)胞，且microRNA含量低?microRNA高度同源，例如hsa-let-7家族各成員?紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血后，會(huì)釋放抑制RT和PCR反應(yīng)的物質(zhì)?常規(guī)內(nèi)參（如U6等）在血清血漿中含量不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參對(duì)照基因準(zhǔn)確檢測(cè)血清/血漿樣本microRNA的利器mi
2015
09-11

原代細(xì)胞傳代技術(shù)
1.選用原代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好（90-95%），生長(zhǎng)數(shù)量大于5×105進(jìn)行傳代。2.吸除原代細(xì)胞培養(yǎng)液。用含雙抗的1×PBS（pH7.4）清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶2次。3.1ml細(xì)胞消化液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞消化液覆細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。4.細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)數(shù)分鐘后，在顯微鏡下觀察原代細(xì)胞的消化狀態(tài)。請(qǐng)記住：如貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形、部分懸浮后，用手指輕輕拍打細(xì)胞培養(yǎng)側(cè)部或底部至大部分貼壁細(xì)胞懸浮，加入細(xì)胞終止液，終止細(xì)胞消化。每種原代細(xì)胞的消化時(shí)間是有差異的。5
2015
09-09

夾心法ELISA用于檢測(cè)IL-8
Il-8是一種分子量為8～10kD的多肽，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞具有趨化作用，并可激活嗜中性粒細(xì)胞，是一種重要的炎癥介質(zhì)。在嚴(yán)重感染病人的血清中、炎癥局部滲出液中都可檢測(cè)到高水平的IL-8。此外，近年來的研究表明，IL-8可能與各種組織缺血后再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。研究人員采用兩株自制的單克隆抗體建立了夾心法ELISA用于檢測(cè)IL-8，敏感性可156Pg/ml。相關(guān)專題ELISA免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)Il-8是一種分子量為8～10kD的多肽，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞具有趨化
2015
09-07

細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理
一、原理培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。二、儀器
2015
09-02

F因子的特性
細(xì)菌的接合zui早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以后在其他菌中也觀察到，主要見于革蘭氏陰性菌。在電鏡下可觀察到細(xì)菌間借伸長(zhǎng)的性菌毛進(jìn)行接合。細(xì)菌能在接合中作為基因傳遞供體取決于致育因子（Fertilityfactor）又稱F因子。細(xì)胞這是zui早發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒。F因子編碼在細(xì)菌表面產(chǎn)生性菌毛。F因子的特性為可以促進(jìn)供體菌向受體菌傳遞染色體DNA或質(zhì)粒。F因子決定編碼的性菌毛可在供體與受體菌間形成交通通連接結(jié)構(gòu)，從而可使兩個(gè)雜交細(xì)菌間形成胞漿內(nèi)連接橋。F因子可以游離存大于胞漿內(nèi)，也可與細(xì)菌染色體整合。如果F因
2015
08-31

熒光抗體染色法
一、原理與意義免疫熒光組織（細(xì)胞）化學(xué)染色方法——補(bǔ)體法，是一種熒光抗體染色法。本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)省免疫血清，尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。二、操作指南1、材料（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效
2015
08-28

免疫熒光的二抗選擇要點(diǎn)
二抗選擇要點(diǎn)（1）種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購(gòu)買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。ELISA試劑盒（2）標(biāo)記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標(biāo)記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標(biāo)記的二抗，以與后面的SP結(jié)合反應(yīng)；而免疫熒光染色就需要購(gòu)買不同熒光素標(biāo)記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。這主要與后面有無三抗和三抗種類有關(guān)。（3）選擇IgM還是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就選擇IgM；反之，一抗是IgG，則二抗選擇IgG。
2015
08-26

細(xì)胞染色的方法
方法1.準(zhǔn)備感興趣的目標(biāo)細(xì)胞。2.表面染色后的細(xì)胞表面抗原。表面標(biāo)記的選擇取決于實(shí)驗(yàn)問題。在不同類型的細(xì)胞的表型標(biāo)記，建3.議請(qǐng)查看相應(yīng)的bestphenotyping標(biāo)記圖：小鼠或人。4.zui后一次洗滌后，加入固定液100μ雖然渦流管和潛伏在黑暗中在室溫下20分鐘修復(fù)細(xì)胞。5.添加1毫升每管通透性緩沖液，離心5分鐘，吸出上清液。6.重復(fù)步驟4。7.懸浮細(xì)胞的通透性的緩沖區(qū)100μL和潛伏在黑暗中在室溫下5分鐘。8.用20μl通透性緩沖抗細(xì)胞因子的單克隆抗體熒光標(biāo)記的*濃度和添加適當(dāng)?shù)墓??；靹?
2015
08-24

免疫組化石蠟切片
1、石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。2、取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）3、每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖
2015
08-21

石蠟切片載玻片的處理
1、載玻片的處理：抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。這里選用ZLI-9001APES、ZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine等幾種試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：（1）APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響
2015
08-19

芽孢桿菌的作用
芽孢桿菌（Bacillus），細(xì)菌的一科，能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處。細(xì)胞1.保濕性強(qiáng)：形成強(qiáng)度極為優(yōu)良的天然材料聚麩胺酸，為土壤的保護(hù)膜，防止肥份及水份流失。2.有機(jī)質(zhì)分解力強(qiáng)：增殖的同時(shí)，會(huì)釋出高活性的分解酵素，將難分解的大分子物質(zhì)分解成可利用的小分子物質(zhì)。細(xì)胞3.產(chǎn)生豐富的代謝生成物：合成多種有機(jī)酸、酶、生理活性等物質(zhì)，及其它多種容易被利用
2015
08-17

引起肺外感染的分枝桿菌
肺外感染部分患者結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散，如腦、腎結(jié)核，痰菌被嚥入消化道也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。國(guó)外有報(bào)道332例血標(biāo)本僅2例培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，但將此標(biāo)本注入豚鼠皮下12%感染結(jié)核。說明結(jié)核分枝桿菌在血中播散的大多不是一般細(xì)菌型，而是一種不易生長(zhǎng)的L型。近年有不少肺外結(jié)核的新報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌的檢出率L型多于細(xì)菌型：如兒童結(jié)核性腦膜炎10例腦脊液培養(yǎng)，9例培養(yǎng)出L型，細(xì)菌型僅1例。老年性前列腺肥大排尿困難，術(shù)后病理切片抗酸菌L型占61.2%，無1例為典型抗酸桿菌。慢性
2015
08-14

熒光抗體染色方法
一、標(biāo)本制作可制作涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定，作免疫熒光染色用。二、熒光抗體染色方法（一）直接法1．染色切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。2．洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽
2015
08-12

制備膠體金的白磷還原法
膠體金可用多種方法制備，其中應(yīng)用較為廣泛的是化學(xué)還原法。這一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子，可用于制備膠體金的還原劑有50余種，但在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)zui為常用的還原劑是白磷、檸檬酸三鈉以及鞣酸等。ELISA試劑盒白磷還原法的建立已有近百年的歷史，由于此法操作較為簡(jiǎn)便，制備出來的膠體金顆粒大小較一致，因而應(yīng)用較為廣泛，現(xiàn)以Faulk和Taylor（1971）的報(bào)道為基礎(chǔ)介紹這一方法。（1）取1%氯化金1.5mli、0.1mol/LK2CO31.2ml,加入
2015
08-10

切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）
抗體稀釋液其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了*防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，我一直用國(guó)產(chǎn)的抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），zui后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增
2015
08-07

植物免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制
“我們識(shí)別出植物細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)關(guān)鍵分子通路。”研究的主要作者、麻薩諸塞州綜合醫(yī)院（MassachusettsGeneralHospital，MGH)分子生物學(xué)部的JenSheen博士說道。“我們發(fā)現(xiàn)如果激活葉子中的這個(gè)通路，葉子抗細(xì)菌和真菌等病原體的能力就會(huì)大大增加?！盨heen表示，植物有著而復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。作用類似人體肌膚的厚厚的表皮細(xì)胞壁就是它們的*道防線。如果病原體能夠穿越這道天然屏障，如通過傷口侵入細(xì)胞，病原體通常也會(huì)被植物細(xì)胞表面或內(nèi)部的受體識(shí)別出來。富含亮氨酸重復(fù)單位（Leucine
2015
08-05

斑點(diǎn)免疫金銀染色法
1984年，Moeremans等將斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法（dot-ELISA）與免疫金銀染色法相結(jié)合，建立了固相載體上的斑點(diǎn)免疫金銀染色法（dot-IGS/IGSS）?？贵w基本原理蛋白質(zhì)抗原通過直接點(diǎn)樣或轉(zhuǎn)移電泳吸附在硝酸纖維素膜（NC膜）上，與特異性抗體反應(yīng)后，在滴加（或浸入）膠體金標(biāo)記的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的粉紅色斑點(diǎn)，稱為斑點(diǎn)免疫金染色（dot-IGS）。此反應(yīng)可再提高銀顯色液增強(qiáng)，即斑點(diǎn)免疫金銀染色法（dot-IGS/IGSS）。試劑及材料1.NC膜2.20m
2015
07-31

PBS的清洗方式選擇
PBS的清洗方式選擇.次數(shù)和時(shí)間的選擇？（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響zui后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對(duì)準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切

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