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ATCC細胞凍存的操作步驟2017/05/09

一、ATCC細胞材料（一）儀器1.凈化工作臺2.離心機3.恒溫水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5.倒置相差顯微鏡6.培養(yǎng)箱7.液氮冰箱（二）玻璃器皿1.吸管（彎頭、直頭）2.培養(yǎng)瓶3.玻璃瓶（250ml、100ml）4.廢液缸（三）塑料器皿1.吸頭2.槍頭3.膠塞4.移液管（10ml）5.15ml離心管6.凍存管（1～2ml）（四）其他物品1.微量加樣槍2.紅血球計數(shù)板3.記號筆4.醫(yī)用橡皮膏5.移液槍（五）試劑1.D-Hanks液2.小牛血清3.培養(yǎng)液4.雙抗（青霉素、鏈霉素）5.胰

細胞培養(yǎng)基常用幾種重要的添加成份及使用過程中應(yīng)注意的問題2017/05/04

酚紅在ATCC細胞培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑，一般情況下，可以通過酚紅的指示作用判斷培養(yǎng)基的pH值，中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色；但低血清或是無血清細胞培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通細胞培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗來判定pH值，建議使用pH計進行測定。酚紅通常對含血清的細胞培養(yǎng)基的生物制品質(zhì)量并不會產(chǎn)生明顯影響，也可通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清細胞培養(yǎng)基中可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細胞生長，這種作用能被血清所中和或減輕。因此，酚紅并不是細胞培養(yǎng)基中必需的一種成份

RNAi基因敲除的優(yōu)點及應(yīng)用2017/04/27

RNAi基因敲除的優(yōu)點及應(yīng)用①.干細胞比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。②.對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。③.由于RNAi能特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導(dǎo)通路的良好工具。④.RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。YAL011WBY4743,homozygousdiploid[30397]Sacchar

ATCC細胞培養(yǎng)中各種器皿滅菌注意事項2017/04/25

1.ATCC細胞清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。2.干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.3.高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干

分析細胞常見的消化液2017/04/20

ATCC細胞取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和edta溶液，有時也用膠原酶(collagenase)溶液。1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液(如前面的D-Hank"s)，因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰

結(jié)晶紫檢測法檢測細胞生長2017/04/18

1．腫瘤細胞在96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4WEHI-164細胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），37℃5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時，讓細胞帖壁。2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標準品，根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復(fù)孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μgTNF的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個陰性對照孔各加100μlRPMI-1640培養(yǎng)液。繼

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞實驗操作步驟2017/04/13

1.1轉(zhuǎn)化細胞細胞鋪板：將細胞按70%的匯合度接種到96孔板。1.2轉(zhuǎn)染：16h后轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因質(zhì)粒和RNA，每個樣品設(shè)置6個復(fù)孔(1)配制DNA和轉(zhuǎn)染試劑:96孔板轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時每孔比例為pLenti：Firefly：Renilla：轉(zhuǎn)染試劑=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL(2)稀釋好DNA及轉(zhuǎn)染試劑，常溫孵育5min(3)將稀釋好的DNA分別和轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min(4)每孔棄去15μL培養(yǎng)基，將15μLDNA轉(zhuǎn)染混合液添加到每孔細胞樣品中(5)轉(zhuǎn)染6h后，換

小白鼠染色體的制備實驗方法和步驟2017/04/11

(一)轉(zhuǎn)化細胞秋水仙素處理取骨髓前3～4小時先給小白鼠經(jīng)腹腔注入0.1％的秋水仙素，注射劑量為4毫克／每公斤動物體重。(二)取骨髓經(jīng)秋水仙素處理的小白鼠，可用損傷脊髓法處死，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨和脛骨，用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭，然后將股骨剪碎投入小燒杯中，用2毫升1％檸檬酸鈉溶液攪爛碎骨，使骨髓細胞游離出來。靜止片刻，用吸管把懸浮液吸到離心管中，可重復(fù)沖洗一次。此時離心管中的細胞懸浮液可達4～5毫升。(三)低滲將所獲得的轉(zhuǎn)化細胞懸

細胞凋亡的變化分析2017/04/06

轉(zhuǎn)化細胞凋亡大多為生理性死亡，是細胞衰老過程中各個細胞功能逐漸減退的結(jié)果。凋亡可見于許多生理和病理過程中，如各種更替性組織衰亡更新，也可見于照射及應(yīng)用細胞抑制劑和數(shù)目性萎縮之時。腫瘤細胞也發(fā)生凋亡。這種壞死是活體內(nèi)單個細胞或小團細胞的死亡，不是整個實質(zhì)區(qū)內(nèi)細胞同時死亡，死亡細胞的質(zhì)膜(細胞膜和細胞器膜)不破裂，不引發(fā)死亡細胞的自溶也不引起急性炎癥反應(yīng)。凋亡的發(fā)生與基因調(diào)節(jié)有關(guān)。也有人稱為程序性死亡(PCD)。轉(zhuǎn)化細胞凋亡對人體的生理平衡和疾病的發(fā)生具有重要意義。電鏡下凋亡的細胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞

ATCC細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點2017/04/01

ATCC細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點血清成分復(fù)雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：1.對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。2.血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(yīng)(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影

新生大鼠頸上交感神經(jīng)元分散細胞培養(yǎng)2017/03/30

干細胞交感神經(jīng)系統(tǒng)在維持機體的正常功能和對環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)中起著十分重要的作用。交感神經(jīng)細胞培養(yǎng)特別有助于神經(jīng)細胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進行交感神經(jīng)細胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質(zhì)表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關(guān)于神經(jīng)營養(yǎng)因子、激素，細胞因子等調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的的機制。1、材料和方法實驗用出生當天的昆明種大鼠，在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側(cè)的頸

CO2培養(yǎng)箱如何消毒2017/03/28

干細胞CO2培養(yǎng)箱如果是隔水式培養(yǎng)箱可以采用甲酸熏蒸(甲醛與高錳酸鉀反應(yīng)生成甲酸)，然后再用75%酒精擦培養(yǎng)箱內(nèi)壁即可，效果比較好。如果是氣套式的培養(yǎng)箱用75%酒精直接擦培養(yǎng)箱內(nèi)壁即可，或采用隔水式熏蒸，但熏蒸前要先將二氧化碳和溫度探頭封閉好，防止甲酸腐蝕。干細胞CO2培養(yǎng)箱是實驗室*的儀器，但因其中需放置盛水容器而濕度較高，從而導(dǎo)致霉斑(經(jīng)培養(yǎng)鑒定為絲狀真菌)快速生長而影響工作，有礙觀瞻和可能導(dǎo)致試驗樣本污染或院內(nèi)感染擴散。雖使用了硫酸銅溶液、75%乙醇溶液或紫外線照射等多種消毒措施，仍然沒有

冷凍細胞活化操作2017/03/23

1、ATCC細胞冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之死亡。2、細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。3、材料37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器4、ATCC細胞步驟：(1)操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。(3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后

冷凍ATCC細胞活化技術(shù)分析2017/03/21

冷凍ATCC細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之死亡。細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。材料37℃恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器步驟：操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。將新鮮培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍

骨髓瘤細胞懸液的制備方法分析2017/03/16

zui常用的干細胞系為SP2/0和NS-1，均來自BALB/c小鼠骨髓瘤。一般在準備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6個月應(yīng)用8-氮雜鳥嘌呤篩選一次，以防止細胞的突變。骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：1．將剛復(fù)蘇的瘤細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，5%C02,37℃溫箱孵育。每2～3天換液一次，3～5天傳代一次，待細胞生長穩(wěn)定后方可供細胞融合用。于融合前48～36小時，將骨髓細胞擴大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗需2～3瓶100m1

腫瘤細胞培養(yǎng)實驗操作分析2017/03/14

腫瘤細胞培養(yǎng)實驗原理：是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。腫瘤細胞動物的選擇：選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13天齡胚胎含有zui大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。每組小鼠胚胎1個實驗材料：每組的超凈臺中有以下物品：1.50ml配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-

細胞消化的操作步驟2017/03/09

1.絕大部分干細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化。比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育。2.細胞如何算是消化好了呢？不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實

死活細胞測定及細胞活力測定實驗原理2017/03/07

(1)干細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過;而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。(2)死活細胞在代謝上的差異：由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱。常見的細胞染料有：中性紅(細胞器的專有染料)、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙醋酸酯(FDA)等。①中性紅染色：常用染料之一，是細胞器的專有染料。利用干細胞膜的通透性差異，用來染原生動物和顯示動植物組織

腫瘤細胞分離中需要注意的幾個問題2017/03/02

1.如果您要做腫瘤細胞培養(yǎng)，記住實驗中所用的試劑(分離液，洗滌液等)、器械等都要是無菌消毒的，并注意實驗中的無菌操作。2.離心轉(zhuǎn)速單位及時間：目前國外的文獻報道基本上用g為單位，注意g和轉(zhuǎn)速(rpm)的換算。3.離心溫度：有的要求室溫，有的要求4攝氏度。實驗的操作要求盡可能熟練，連貫。4.在用Ficoll分離單個核腫瘤細胞(PBMC)時，通常含有少量的紅細胞，對于一般的實驗影響不大，如果實驗要求較高，可采取裂解液(有的需要無菌)，并注意裂解時間控制，以免影響單個核細胞的活性。5.在用Percol

細胞培養(yǎng)的各種器皿的物理消毒滅菌法2017/02/23

轉(zhuǎn)化細胞通過高潮、射線、微波以及器械進行滅菌或除菌的方法均為物理滅菌方法。(1)紫外線消毒用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。(2)干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90-120min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5-8h。(3)濕熱滅菌此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是zui有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料