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轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的準(zhǔn)備工作2017/07/25: 一、轉(zhuǎn)化細(xì)胞準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。1、清潔、消毒、液體直接接觸細(xì)胞的用品要超凈處理——無非必須分子直接接觸細(xì)胞的用品要*消除微生物超凈和消毒過的樣品要密閉保存，標(biāo)記消毒時間實(shí)驗(yàn)室保持潔凈，隨時消毒盡量采用商品化一次性用品操作者也要清潔和消毒緩沖液要符合生理滲透壓（280～310mOsm）和pH

體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測2017/07/20: 一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明：所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項(xiàng)目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn)。【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等?！炯?xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞

間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化2017/07/18: 成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細(xì)胞的一種重要的方法，也是zui常用、報道見得zui多的方法。成骨zui常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)zui常用是OilRedO（油紅O）染色法。下面介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色方法和原理：茜素紅又名茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯。1%水溶液pH為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫

轉(zhuǎn)化細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式2017/07/13: 轉(zhuǎn)化細(xì)胞深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。一、分批式培養(yǎng)（batchculture）是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。該方式的特點(diǎn):操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法2017/07/11: 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。1、取材：人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。2、培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)

ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)介紹2017/07/06: ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法不同，對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響很大。常見的轉(zhuǎn)染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞原理得到瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果，操作簡便但重復(fù)性差，不可用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，可用于瞬時轉(zhuǎn)染，方法相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細(xì)胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染均適用。適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA

細(xì)胞死亡的檢驗(yàn)方式2017/07/04: ATCC細(xì)胞發(fā)生凋亡時具有固有的形態(tài)特征,如細(xì)胞核表現(xiàn)縮小、染色質(zhì)邊緣化、凝集,凋亡晚期還會出現(xiàn)由核碎片與胞質(zhì)內(nèi)的部分細(xì)胞器混合在一起,且被細(xì)胞膜包裹形成的凋亡小體。DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區(qū)進(jìn)行非嵌入式結(jié)合,從而使細(xì)胞核著色,在紫外光激發(fā)時會出現(xiàn)明顯的熒光。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化、膜結(jié)構(gòu)及通透性的改變,從而鑒別凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞及壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果直觀,至

細(xì)胞分裂指數(shù)操作說明書2017/06/29: 【實(shí)驗(yàn)用品】材料：貼壁培養(yǎng)的ATCC細(xì)胞器材：離心機(jī)、顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板試劑：Hanks液、0．25％胰蛋白酶、含10％小牛血清／胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可以是其他種類的培養(yǎng)基)【實(shí)驗(yàn)步驟】(1)用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞置于10ml離心管中，1000r／min離心5min，棄上清。(2)加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液。(3)吹打均勻后，對ATCC細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。(4)按2x104～5x104／ml的密度將細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。(5)每天

細(xì)胞生長曲線的繪制操作步驟2017/06/27: ATCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用品材料：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞器材：24孔培養(yǎng)孔板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對數(shù)坐標(biāo)紙、蓋玻片、細(xì)胞計數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機(jī)、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱試劑：Hanks液、DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)、0.25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液實(shí)驗(yàn)步驟(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于10ml離心管中。(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。(3)加入DMEM培養(yǎng)基(含10％

分析培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞狀態(tài)欠佳的原因2017/06/22: 1、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的新鮮程度：一般加入血清后的*培養(yǎng)基，2周內(nèi)用完。否則血清有效成分失活，影響細(xì)胞培養(yǎng)。建議：*培養(yǎng)基一次不要配太多，200ml以下?；蚋鶕?jù)用量決定。2、細(xì)胞外源微生物的污染：細(xì)胞不宜長期體外培養(yǎng)，因?yàn)橥庠次⑸镂廴镜膸茁蚀蟠筇岣?。易發(fā)現(xiàn)和難發(fā)現(xiàn)的。影響細(xì)胞狀態(tài)。建議：實(shí)驗(yàn)前凍存一批細(xì)胞，隔幾個月重新復(fù)蘇。即保證實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)一致，又將外源污染的后果降到zui低。3、排除其他原因：如更換培養(yǎng)條件（血清、培養(yǎng)基等）；腫瘤細(xì)胞使用器皿的潔凈程度；人表皮黑色素細(xì)胞-深色素微小RNA英

血管內(nèi)皮細(xì)胞特性2017/06/20: 1．血管內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志（1）轉(zhuǎn)化細(xì)胞第Ⅷ因子關(guān)連抗原，可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，檢測這一因子主要用相應(yīng)抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng)。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細(xì)胞邊緣顆粒較少。（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內(nèi)皮細(xì)胞又一特異性的標(biāo)志。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)。上述的VWF就是該小體產(chǎn)生的。2．培養(yǎng)的大動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上可

ATCC細(xì)胞肉眼觀察檢測方法2017/06/15: ATCC細(xì)胞一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。培養(yǎng)細(xì)胞的觀察檢測方法大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2～7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6對細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。細(xì)胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細(xì)胞生長有利。隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放CO2增多，使pH降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。對細(xì)胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時能維持較恒定的pH值。

細(xì)胞常見的轉(zhuǎn)染方法分析2017/06/13: ATCC細(xì)胞常見的轉(zhuǎn)染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞原理得到瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果，操作簡便但重復(fù)性差，不可用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，可用于瞬時轉(zhuǎn)染，方法相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細(xì)胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染均適用。適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)操作注意事項(xiàng)2017/06/08: 1.腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等

轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室*儀器簡單介紹2017/06/06: 一、CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱是轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)的*儀器，它為細(xì)胞提供了一個體外培養(yǎng)的舒適環(huán)境，如適宜的溫度、濕度、酸堿度、O2濃度等。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時很容易受到各種細(xì)菌、微生物的感染，因此，CO2培養(yǎng)箱的滅菌和抑菌能力就顯得尤為重要。二、純水系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)用水一般要求雙蒸水(0.8MΩ以上)，實(shí)際上普通蒸餾水經(jīng)玻璃器皿中按標(biāo)準(zhǔn)方法蒸餾二次得到的雙蒸水是不能滿足要求的，而且水中的內(nèi)毒素直接參與細(xì)胞凋亡，血清中內(nèi)毒素含量越低，對細(xì)胞毒性越小，越利于細(xì)胞的生長和傳代;內(nèi)毒素含量過高，會直接導(dǎo)致細(xì)胞提前老化。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時注意事項(xiàng)2017/06/01: 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時注意事項(xiàng)1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上;2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上;3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;4.消化液(pH7.8)或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-2

ATCC細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題和解決方法2017/05/25: 一、培養(yǎng)ATCC細(xì)胞不貼壁可能原因：胰蛋白酶消化過度支原體污染培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）細(xì)胞老化接種細(xì)胞起始濃度太低或太高解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2啟用新的保種細(xì)胞調(diào)節(jié)*接種細(xì)胞濃度二、懸浮細(xì)胞成簇可能原因：培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子；支原體污染；蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解；DNA污染解決方法：用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液；分離培養(yǎng)

介紹在細(xì)胞培養(yǎng)過程中經(jīng)常用到的培養(yǎng)用液有哪些2017/05/23: 一、干細(xì)胞平衡鹽溶液(balancedsaltsolution,BSS):主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank"s與Hank"s的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank"s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hank"s平衡液僅含有0.35g/LNaHCO

分析ATCC細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)注意事項(xiàng)2017/05/18: 1.ATCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管

分析干細(xì)胞的幾大特點(diǎn)2017/05/16: 1.生命的起源細(xì)胞人體起源一個單細(xì)胞受精卵（*代干細(xì)胞），經(jīng)歷卵裂（干細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增，增加細(xì)胞數(shù)量）、胚層出現(xiàn)（干細(xì)胞開始分化出功能細(xì)胞）、組織器官形成（功能細(xì)胞的有序排列）及胚后發(fā)育這樣一個連續(xù)過程。2.維持人體動態(tài)平衡的種子細(xì)胞人體通過干細(xì)胞增殖和分化來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞更新。成年并不意味著細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的結(jié)束，而仍然存在著受調(diào)控的組織更新過程。在一些組織中，如骨髓、表皮等，新細(xì)胞可不斷地產(chǎn)生，以補(bǔ)充因分化而衰老、死亡的細(xì)胞。干細(xì)胞的增殖保持著機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的動態(tài)平衡。3.干細(xì)胞功能表達(dá)體現(xiàn)出生命發(fā)育、

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