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2018
03-28

ELISA trouble shooting
問題一:陰性對照出現(xiàn)陽性結果可能的原因解決的方法試劑/樣品污染試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器夾心ELISA-檢測抗體與包被抗體反應確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，他們之間不會相互反應酶標板洗板不*用洗液充滿板空確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈抗體量過多導致非特異性結合根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體問題二：酶標板整體背景高可能的原因解決的方法結合反應太強或時間過長檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當酶標儀顯色足夠
2018
03-26

IHC Trouble Shooting
問題一：缺乏染色可能的原因檢測方法和相應的措施沒有抗原用原位雜交的方法檢測蛋白表達（有時即使能檢測到mRNA。翻譯也有可能受阻）由于錯誤的儲存方法按照說明書儲存。通常，將抗體按照足夠配制單次實驗工作溶液的體積分裝。儲存在手動除霜冰箱中（-20到-70℃），避免反復凍融無效的一抗或二抗單獨檢查報告系統(tǒng)以評估試劑的有效性。固定不充分嘗試增加固定時間或改用不同的固定劑過度固定減少浸潤或固定后步驟的時間。如果必須使用浸潤法固定（例如病理實驗室中的尸檢組織或切片），可以用抗原修復試劑修復被遮蔽的表位不兼容
2018
03-26

羊血清在免疫組化中的作用
都說是封閉，羊血清究竟封閉的是什么（抗原？）那接下來加一抗怎么又能反應結合？不是封閉了嗎？封閉的目的是為了減少非特異染色。這里，允許小編介紹下免疫組化中封閉血清的原理，封閉血清的原理主要有兩點：*是待檢樣本會非特異性的和蛋白結合，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc
2018
03-22

IP trouble shooting
問題一：高背景可能的原因解決方法去污劑不溶性蛋白有殘留離心后立即去除上清，沉淀中留有不溶性蛋白質(zhì)，如果再次有懸浮發(fā)生，再次離心洗滌不充分蓋上管蓋離心前反復顛倒幾次非特異性蛋白質(zhì)與珠子結合珠子用BSA預封閉不充分，確保牛血清白蛋白（組分V）新鮮，新鮮珠子與含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小時，使用前PBS洗3-4次使用的抗體特異性不強使用親和純化的抗體，預先吸收使用太多抗體導致非特異性結合檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體細胞裂解液中含有太多的細胞或太多蛋白，導致洗脫液中很多額外的（假陽性）蛋白
2018
03-20

WB Trouble Shooting
問題一：轉膜不充分可能的原因驗證或解決方法膜沒有*均勻濕透使用100%甲醇浸透膜靶蛋白分子量小于10kDa選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液PH值可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH10.5）或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過高過高甲醇濃度濃度會導致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉移時間不夠對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間問題二：背景高可能的原因驗證或
2018
03-15

預制膠常見問題指南
注意事項★一定要使用我們盒內(nèi)配套的電泳緩沖液；★上樣量和濃度不能過高。1.我們的預制膠與哪些品牌電泳槽兼容？●Bio-RadMini-PROTEAN(II/3/TetraSystem)；●HoeferMightySmall(SE250/SE260/SE280)；●LifeTechnology(Invitrogen)；●NovexMini-Cell；●MiniGelTank(A25977)(請與EZbiolab特制擋板配合使用)；●北京六一DYCZ-25E；●君意東方JY-SCZ2+；●天能VE1
2018
03-13

【推薦】蛋白marker精彩問答
WesternBlot（WB）即蛋白免疫印跡實驗，是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小講蛋白分離，再通過電場力將蛋白轉移到雜交膜上。然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質(zhì)分析zui流行和成熟的技術之一。在WB過程中，分子量Marker就像個螺絲釘一樣，只是個小細節(jié)，然而就是這樣一個小細節(jié)對實驗結果有著不可忽視的作用。這個WB參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小，只有標準量無誤了，實驗結果才有說服力，除此之外，蛋白標準還有表示轉移成功或
2018
03-09

IHC、ELISA和WB區(qū)別
免疫學三大工具，IHC、Westernblot、ELISA，分別用于定位，定性和定量!IHC（免疫組化）是融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來對組織（細胞）內(nèi)抗原進行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。樣本是細胞或組織，要在顯微鏡下觀察結果，可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）用到了免疫學原理和化學反應顯色，待測的樣品多是血清、血漿、尿液
2018
03-07

血清那些事兒
血清小知識血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，其主要作用是提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保護作用。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛
2018
02-28

免疫組化步驟剖析（二）
1、血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性；因此需要使用封閉劑進行封閉。常用試劑為血清和BSA等。封閉血清一般是和二抗同一來源的，但不能與一抗來源一致。2、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間：一抗孵育條件在免疫組化反應中zui重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時間與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，4度過夜（從冰箱拿出后37度復溫45min）。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間
2018
02-24

免疫（共）沉淀（IP/CoIP）試劑盒常見問題匯總
Q：步驟上的可選步驟能否省略？A：該試劑盒是經(jīng)過實驗驗證的，再進行驗證實驗的時候實驗室都是要做這個可選步驟的，建議不要省略，按照說明書操作。Q：proteinA和proteinGbeads怎么選？A：各5ul就可以了Q：超聲破碎冰上操作是必須的嗎？4℃條件能否微調(diào)？A：建議冰上操作，4℃是可以微調(diào)的。Q：beads出現(xiàn)吸不出來的情況，怎么處理？A：吸之前需注意槍頭要剪一下再吸，如若beads吸不上來，可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。Q：如果沒有超聲破碎儀的話，能不能用酶解的辦法破碎細胞？A：
2018
02-05

標簽抗體知多少
標簽抗體，別名為抗原表位，又稱抗原決定簇，是抗原分子中決定抗原特異性的特殊區(qū)域或基團，是與抗體特異性結合的結構或序列。隨著生物技術的發(fā)展，科研人員可以通過DNA重組技術，構建包含目的基因以及表位標記的融合蛋白，進而通過特異性標簽抗體對其鑒定與純化，以達到研究的需求。常用的標簽包括myc、HA、Flag、His、GST等。1.Flag標簽—抗Flag標簽抗體Flag標簽系統(tǒng)是利用一個短的親水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)融合到目標蛋白。Flag標簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應用于各種
2017
12-22

免疫組化的實驗步驟剖析（一）
1、標本固定：固定的目的是：①，防止標本從玻片上脫落；②，除去防礙抗原—抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③，固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛。2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要*浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則容易裂片和脫片等。3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高
2017
12-15

產(chǎn)品問答之霍亂毒素B亞單位（CTB）
Q:什么是霍亂毒素？A:霍亂毒素由（Choleratoxin,CT）兩個亞單位組成，即A亞單位（CTA）和B亞單位（CTB）。A亞單位是霍亂毒素的活性部分，B亞單位的主要功能是通過與哺乳動物小腸上皮細胞上的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結合而使得A亞單位進入細胞。Q:霍亂毒素是如何反激活的？A:霍亂毒素由霍亂操縱子（ctx）編碼，從5'到3'方向，依次是反激活因子ToxR的識別序列、啟動子、A基因（ctxA）、B基因（ctxB）和不依賴于r因子的轉錄終止系列。現(xiàn)在普遍認為操縱子中只有一個啟動子，ctx
2017
11-30

血清常見問題解答
血清小知識血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，其主要作用是提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保護作用。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛
2017
11-23

蛋白Marker使用指南
在westernBlot過程中，蛋白Marker雖然是其中小小的一環(huán)，但是這個小細節(jié)對實驗結果的影響不可忽視。Marker在蛋白電泳中的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小，只有標準量無誤，實驗結果才有說服力。此外，Marker還能顯示轉膜是否成功以及蛋白在凝膠上的電泳程度的作用。因此選擇正確的蛋白Marker也是westernblot實驗成功的必要條件之一?？傮w來說，蛋白分子量標準可以分成未染蛋白分子量標準、預染蛋白分子量標準二個級別。未染色的蛋白分子量標準未染色的蛋白分子量標準是zu
2017
11-17

WB試驗之如何選擇內(nèi)參抗體
檢測某一個基因的表達產(chǎn)物或者要比較表達產(chǎn)物量的相對變化，方法是westernblot。而WesternBlot試驗中比較這些的前提條件是等量的細胞上樣，這樣才有比較的基礎。而人為的操作會產(chǎn)生一定的誤差，這些誤差可以通過測定每個樣品中實際轉到膜上的內(nèi)參來校正。因此選擇一個合適的內(nèi)參抗體來校正上樣誤差是非常重要的。所以嚴謹?shù)腤esternBlot實驗設計中需要有良好的參照體系，后續(xù)的實驗結果分析才具有說服性。在WesternBloting實驗中，可能內(nèi)參即是內(nèi)部參照(InternalControl)
2017
10-10

預制膠—讓您的WB省時省力更省心
Westernblotting是一個步驟繁多的實驗，每一步都會對zui后的結果產(chǎn)生影響，電泳過程是其中關鍵重要的一步。好的電泳能讓目的條帶整齊，結果圖讓人眼前一亮。要做好電泳也并非易事，凝膠質(zhì)量在其中扮演著重要作用。電泳的支持介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠的聚合由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體在自由基的催化下完成。常用的催化聚合方法有兩種，分別為化學聚合法和光聚合法，實驗室配制凝膠通常為化學聚合。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生
2017
09-21

MAPK級聯(lián)激活
絲裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要傳遞者，其調(diào)節(jié)轉錄因子和相關酶的活性，參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關。MAPK是一組能被不同的細胞外刺激，如細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。該通路的基本組成是一種從酵母到人類都保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAPkinasekinasekinase，MKKK）、MAPK
2017
09-05

抗體相關問題FAQ
1.如何保存和分裝抗體？對于許多抗體而言，分裝為小等份在-20℃或-80℃下凍存是*的保存條件。抗體保存應避免反復凍融，分裝可以zui大限度減少凍融對抗體造成的損壞，還可避免多次從同一管中移取抗體而引入污染。但是每份不應該少于10uL。分裝的體積越小，抗體的濃度受蒸發(fā)和管壁吸附的影響就會越大。大部分情況下，抗體在4℃條件下能夠保存1-2周。但有部分特例。為了防止微生物污染，可在抗體中加入適當濃度的NaN3。如果要用抗體對活細胞進行染色或處理，或者要用抗體進行體內(nèi)研究，則不能使用含NaN3的抗體制

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