產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：人間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基

貨號(hào)： RC200101

批號(hào)：見(jiàn)包裝

試劑清單：

存儲(chǔ)與有效期：

組分A于2-8 ℃保存，組分B于-20 ℃保存。所有組分均須避免反復(fù)凍融及復(fù)溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養(yǎng)基于2-8 ℃保存，穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周。

適用細(xì)胞：

適用于人骨髓、脂肪、臍帶等組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離、擴(kuò)增與傳代培養(yǎng)。

操作方法

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基配制：
• 添加劑處理：37℃快速解凍人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑（RC200101-B），快速溶解有利于保護(hù)添加劑中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不被破壞，時(shí)間約為10分鐘。添加劑融化后輕輕充分搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即存儲(chǔ)于-20℃至-80℃，避免反復(fù)凍融。
• 剛?cè)诨呐囵B(yǎng)基添加劑可能會(huì)有溶解不充分，出現(xiàn)類似沉淀物，請(qǐng)務(wù)必充分混勻，以保證添加的均勻度。
• *培養(yǎng)基配制：將添加劑以10%比例加入到人間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RC200101-A）中，充分混勻，即配制成人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基（RC200101）。*培養(yǎng)基在2-8℃可穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周，超過(guò)3周的*培養(yǎng)基請(qǐng)謹(jǐn)慎使用。
• 混合成人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基后必須充分混勻，2-8 ℃保存。整個(gè)過(guò)程確保無(wú)菌操作，各試劑開(kāi)封前以75%酒精擦拭表面。*培養(yǎng)基使用前務(wù)必室溫復(fù)溫30分鐘。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • 細(xì)胞凍存液

操作方法（參考，請(qǐng)根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)需求自行制定操作規(guī)程）

• 原代細(xì)胞培養(yǎng)（羊水、全血、全骨髓培養(yǎng)發(fā)法、酶消化法）：
  1. 該部分以單細(xì)胞懸液為操作起始。單細(xì)胞獲取方式包括但不限于使用胰酶、膠原酶、分散酶等酶消化法從脂肪、臍帶、羊膜、皮膚等組織獲得；使用離心法直接從羊水、全血、全骨髓獲得。
  2. 原代接種：以上方法獲得的細(xì)胞沉淀，漩渦震蕩使其分散為單個(gè)細(xì)胞，加入適量的*培養(yǎng)基，充分混勻。200 g離心5-10分鐘。棄去上清，漩渦震蕩使沉淀分散為單個(gè)細(xì)胞，加入適量的*培養(yǎng)基，充分混勻。按照一定的細(xì)胞密度接種與培養(yǎng)器皿中。37℃、5%CO₂、飽和濕度靜置培養(yǎng)48小時(shí)。該時(shí)間段內(nèi)請(qǐng)勿移動(dòng)培養(yǎng)器皿，也無(wú)需觀察。48小時(shí)后觀察細(xì)胞，根據(jù)情況選擇半量或全量更換新鮮*培養(yǎng)基。
  3. 換液培養(yǎng)：后每48小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)上清。若懸浮細(xì)胞較多，則可用DPBS輕輕洗滌細(xì)胞1-2次。添加新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
  4. 傳代：原代細(xì)胞傳代以克隆大小和克隆中心細(xì)胞密度為標(biāo)準(zhǔn)。若克隆中心細(xì)胞密度較大，則不論整個(gè)培養(yǎng)器皿是否長(zhǎng)滿均應(yīng)進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)上清，加入適量的DPBS，輕輕晃動(dòng)后棄去DPBS，重復(fù)洗滌2-3次。加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液室溫消化2分鐘，加入2倍體積的*培養(yǎng)基終止消化。用移液管、吸管、移液槍頭等輕輕吹打細(xì)胞，使其從培養(yǎng)皿表面脫落。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細(xì)胞凍存”。
• 原代細(xì)胞培養(yǎng)（組織塊法）：
  1. 該部分以組織塊作為起始。組織塊包括但不限于臍帶、羊膜、皮膚等來(lái)源的切成1-3 mm³大小的組織塊。
  2. 原代接種：用緩沖液清洗過(guò)的組織塊，用適量的*培養(yǎng)基懸浮，300目無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾或200 g離心5-10分鐘，收集組織塊。用適量的*培養(yǎng)基重新懸浮組織塊，均勻接種于培養(yǎng)皿中，37 ℃、飽和濕度、5%CO₂靜置培養(yǎng)。48小時(shí)內(nèi)最hao不要對(duì)培養(yǎng)器皿進(jìn)行任何移動(dòng)。
  3. 換液：48小時(shí)后進(jìn)行半量換液或全量換液，具體視情況而定。每2天更換新鮮培養(yǎng)液。組織塊周圍有密度較高的細(xì)胞時(shí)，可以選擇去除組織塊。
  4. 傳代：參照上述“傳代”方法。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細(xì)胞凍存”。
• hMSC細(xì)胞傳代培養(yǎng)（非原代）：
  1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%，即可傳代。
  2. 棄掉培養(yǎng)上清，加入DPBS溶液清洗1次，加入細(xì)胞消化液使之*覆蓋培養(yǎng)器皿底部。
  3. 室溫孵育1分鐘，輕輕拍動(dòng)培養(yǎng)器皿，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞從培養(yǎng)器皿底部脫落后立即停止消化。
  4. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未*脫離的細(xì)胞，使細(xì)胞*脫落并均勻分散。
  5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，200 g離心5分鐘。
  6. 棄上清，加入人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。1：3-1：6比例傳代，均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
• hMSC細(xì)胞復(fù)蘇：
  1. 從液氮中取出凍存的hMSC細(xì)胞，迅速將凍存管/凍存袋放入復(fù)蘇裝置或37℃水浴快速融化。
  2. 將解凍后的細(xì)胞懸液緩慢加入適量已復(fù)溫的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基（凍存體積與培養(yǎng)基的體積比為1：5-1：10）。
  3. 200 g離心5分鐘，吸掉上清，加入適量的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
  4. 將細(xì)胞均勻鋪到培養(yǎng)器皿中，搖動(dòng)培養(yǎng)器皿使細(xì)胞均勻分布，5%CO₂的37℃培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)。
  5. 24小時(shí)后更換新鮮人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液。
• 細(xì)胞傳代所需的時(shí)間：2-4天。hMSC消化極易過(guò)度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴(yán)格控制消化時(shí)間。
• hMSC細(xì)胞凍存
  1. 細(xì)胞達(dá)到90%匯合度，棄掉原有培養(yǎng)基，DPBS清洗1次。
  2. 加入細(xì)胞消化液使之*覆蓋培養(yǎng)器皿底部，室溫孵育1分鐘，輕輕拍動(dòng)培養(yǎng)器皿，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞從培養(yǎng)器皿底部脫落后立即停止消化。
  3. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未*脫離的細(xì)胞，使細(xì)胞*脫落并均勻分散。
  4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，200 g離心5分鐘，吸掉上清。
  5. 加入適量細(xì)胞凍存液，調(diào)整細(xì)胞凍存密度在1×10⁶ cells/cm₂左右，每支凍存管分裝0.5-1 ml，使用凍存袋凍存請(qǐng)自行根據(jù)需要選擇凍存方案。
  6. 程序降溫儀凍存，或放入凍存盒然后置于-80 ℃或直接放入-80 ℃，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

• 以上所有操作均在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行，細(xì)胞開(kāi)放操作要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；hMSC切忌消化過(guò)度，過(guò)度的消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞快速老化，且失去部分或全部分化能力；正常條件下hMSC可傳代至15代，實(shí)驗(yàn)室具體可操作的傳代次數(shù)請(qǐng)自行分析判斷，并建議以分化能力進(jìn)行判別；該培養(yǎng)基只用于hMSC細(xì)胞培養(yǎng)，操作規(guī)程僅作為參考。

文獻(xiàn)引用

 趙鵬. 人VEGF基因修飾脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨特性研究[D].南華大學(xué),2020.

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