人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)試劑盒

僅用于科學(xué)研究

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)試劑盒

貨號(hào)：FY200008

批號(hào)：見包裝

存儲(chǔ)與有效期：

組分A、E于2-8 ℃避光保存，組分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有組分均須避免反復(fù)凍融及復(fù)溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的預(yù)混液于2-8 ℃保存，有效期1個(gè)月，*培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，2-8 ℃保存不超過72 小時(shí)。

適用細(xì)胞：

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，其他組織來(lái)源的人間充質(zhì)干細(xì)胞。

產(chǎn)品介紹

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞。2006年國(guó)ji細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）確定此三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)是MSC鑒定的必檢項(xiàng)目，目前以MSC為基礎(chǔ)的研究報(bào)道均會(huì)對(duì)該三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行鑒定。在多種組織來(lái)源和制作方法的MSC藥品質(zhì)量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標(biāo)。

為滿足科研和制藥對(duì)MSC分化能力的鑒定，弗元生物結(jié)合多年MSC研究經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化MSC誘導(dǎo)試劑盒，在穩(wěn)定性、易用性上大幅改進(jìn)，采用了精心設(shè)計(jì)的小包裝。該試劑盒的設(shè)計(jì)用途，首先，用于鑒定人MSC是否具有成骨分化能力，滿足MSC質(zhì)量控制的要求。其次，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基也可作為除支架以外的培養(yǎng)培養(yǎng)體系。另外，誘導(dǎo)培養(yǎng)基還可用于研究誘導(dǎo)分化過程中的其他檢測(cè)，如mRNA檢測(cè)、lncRNA檢測(cè)、microRNA檢測(cè)、蛋白表達(dá)檢測(cè)、膠原含量檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)等。

本產(chǎn)品僅適用于科學(xué)研究。

操作方法

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 試劑配制：
• ：室溫融化添加物B和添加物C，將融化后加入A液，充分混勻，配制成軟骨分化培養(yǎng)基預(yù)混液。
• 添加物解凍后旋渦混勻、1000 g短時(shí)離心以使溶液集中于管底。將管內(nèi)溶液加入A液后，吸取A液洗滌溶液瓶?jī)纱危瑢⑾礈煲杭尤?/span>A液中。預(yù)混液必須充分混勻，2-8 ℃保存。
• ：取10 ml預(yù)混液置于15 ml離心管中，加入一支添加物D，充分混勻制成誘導(dǎo)*培養(yǎng)基，此液現(xiàn)配現(xiàn)用。1 ml預(yù)混液需加入添加物D的量為10 μl。
• 誘導(dǎo)*培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，2-8 ℃放置不得超過72小時(shí)。整個(gè)過程須確保無(wú)菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • MSC*培養(yǎng)基
  • 4%中性多聚甲醛溶液
• 若MSC*培養(yǎng)基不含血清，則需要準(zhǔn)備胰酶抑制劑。MSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴(yán)格控制消化時(shí)間。

操作步驟

1. 準(zhǔn)備所需誘導(dǎo)分化的MSC，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)85%左右時(shí)，用消化液消化細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用成軟骨誘導(dǎo)預(yù)混液重懸。
2. 220 g離心5 分鐘，沉淀以預(yù)混液重懸，細(xì)胞密度約2×10⁶ cells/ml，再次離心，棄上清。
3. 沉淀以成軟骨誘導(dǎo)*培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁶ cells/ml。
4. 分別取500 μl細(xì)胞懸液接種于15 ml離心管中，220 g離心5 分鐘。
5. 每管細(xì)胞的總數(shù)在5×10⁵至1×10⁶之間，一般以1個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種一個(gè)軟骨球?yàn)榧?，?xì)胞數(shù)過少形成的軟骨團(tuán)塊較小，細(xì)胞數(shù)過多則可能會(huì)分開成塊。正常情況下可形成1-2 mm³的團(tuán)塊。離心以細(xì)胞聚團(tuán)為準(zhǔn)，可適當(dāng)調(diào)整。離心力過大，軟骨球不易懸浮，離心力過小則可能形成軟骨球效果不佳。
5. 旋松離心管蓋，將離心管輕輕豎直置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
6. 24 小時(shí)內(nèi)避免搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，以確保形成個(gè)團(tuán)塊。離心管需使用聚丙烯材質(zhì)無(wú)菌管。
6. 誘導(dǎo)培養(yǎng)24 小時(shí)后，輕輕撥動(dòng)離心管底，使細(xì)胞沉淀團(tuán)塊懸浮，重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 細(xì)胞團(tuán)塊重新懸浮的時(shí)間因細(xì)胞而定，基本在24-48 小時(shí)之間，以細(xì)胞團(tuán)周圍有聚攏現(xiàn)象時(shí)為準(zhǔn)。若細(xì)胞團(tuán)塊貼壁較牢固，可用移液器輕輕吹動(dòng)使其懸浮，注意不要吹散團(tuán)塊。
7. 每2天更換新鮮*誘導(dǎo)培養(yǎng)基。換液時(shí)輕輕吸去舊培養(yǎng)基，每管加新鮮配制的成軟骨分化*培養(yǎng)基500 μl。
8. 換液時(shí)動(dòng)作輕柔，以免吸出細(xì)胞團(tuán)塊；誘導(dǎo)*培養(yǎng)基必須經(jīng)過復(fù)溫，否則影響誘導(dǎo)效果。在誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)，富含軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原。
8. 誘導(dǎo)培養(yǎng)14-20天，棄去培養(yǎng)上清，DPBS洗細(xì)胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室溫固定細(xì)胞1小時(shí)。
9. 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)或中途可以選擇其他檢測(cè)方法，如基因表達(dá)檢測(cè)等，若采用自己擬定的檢測(cè)方法則后續(xù)方案需要自己擬定。一般軟骨球誘導(dǎo)致密后能進(jìn)行染色處理，時(shí)間在14-20天左右，時(shí)間過久可能導(dǎo)致團(tuán)塊內(nèi)部出現(xiàn)空泡，甚至團(tuán)塊裂開，具體時(shí)間請(qǐng)以自己細(xì)胞的特性自行確定。
9. 棄去固定液，DPBS洗2次，脫水、石蠟包埋后切片。
10. 脫水包埋可以用擦鏡紙包裹后使用自動(dòng)脫水機(jī)脫水、包埋，也可以在原離心管中逐級(jí)更換脫水、透蠟的液體，手工包埋。過程中一定注意團(tuán)塊不要丟失。
10. 阿利新藍(lán)染色：將切片進(jìn)行脫臘和復(fù)水，阿利新藍(lán)染液染色30 分鐘，流水沖洗5 分鐘，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。
11. 染色和制片過程中避免干片，干片后會(huì)導(dǎo)致組織形態(tài)發(fā)生變化，影響觀察、拍照效果。根據(jù)需要可以選擇蘇木素復(fù)染，不建議復(fù)染。
11. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見藍(lán)色著色，該藍(lán)色染色的為酸性粘多糖，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無(wú)成軟骨能力。
12. 該鑒定方法和判定標(biāo)準(zhǔn)為定性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體情況設(shè)置其他判定方法和標(biāo)準(zhǔn)。以上提供的是包埋切片染色的方案，若實(shí)驗(yàn)室條件限制，可選擇直接對(duì)團(tuán)塊進(jìn)行染色，方法見B9、B10、B11。若試劑盒用于組織工程軟骨誘導(dǎo)，可作為除支架材料以外的誘導(dǎo)液使用。
13. 棄去固定液，DPBS洗團(tuán)塊2次。
14. 阿利新藍(lán)染色：向團(tuán)塊中加500 μl阿利新藍(lán)染液染色30 分鐘。棄染色液，加純水5 ml搖動(dòng)清洗5分鐘/次，反復(fù)洗5次。
15. 染色液中的團(tuán)塊不易看清，務(wù)必小心吸去上清，避免樣本丟失。
16. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見深藍(lán)色著色，該藍(lán)色染色的為酸性粘多糖，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無(wú)成軟骨能力。