人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)試劑盒

僅用于科學(xué)研究

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)試劑盒

貨號(hào)：FY200007

批號(hào)：見包裝

存儲(chǔ)與有效期：

組分A、D、E于2-8 ℃避光保存，組分B、C于-20 ℃避光保存。所有組分均須避免反復(fù)凍融及復(fù)溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養(yǎng)基于2-8 ℃保存，有效期1個(gè)月。

適用細(xì)胞：

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，其他組織來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞。

產(chǎn)品介紹

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞。2006年國(guó)ji細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）確定此三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)是MSC鑒定的必檢項(xiàng)目，目前以MSC為基礎(chǔ)的研究報(bào)道均會(huì)對(duì)該三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行鑒定。在多種組織來源和制作方法的MSC藥品質(zhì)量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標(biāo)。

為滿足科研和制藥對(duì)MSC分化能力的鑒定，弗元生物結(jié)合多年MSC研究經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化MSC誘導(dǎo)試劑盒，在穩(wěn)定性、易用性上大幅改進(jìn)，采用了精心設(shè)計(jì)的小包裝。該試劑盒的設(shè)計(jì)用途，首先，用于鑒定人MSC是否具有成脂分化能力，滿足MSC質(zhì)量控制的要求。其次，誘導(dǎo)培養(yǎng)基還可用于研究誘導(dǎo)分化過程中的其他檢測(cè)，如mRNA檢測(cè)、lncRNA檢測(cè)、microRNA檢測(cè)、蛋白表達(dá)檢測(cè)、油脂定量檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)等。再者，該產(chǎn)品誘導(dǎo)MSC分化為的脂肪細(xì)胞多為多泡脂肪細(xì)胞樣，當(dāng)脂肪滴融合過大時(shí)容易脫壁，難見單泡脂肪細(xì)胞樣。用于脂肪研究可斟酌使用本產(chǎn)品。

本產(chǎn)品僅適用于科學(xué)研究。

操作方法

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 試劑配制：
• B：2-8℃過夜融化添加物B液，B液使用前須37℃復(fù)溫30分鐘，充分混勻。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基A液平均分成2份，各45 ml，加入添加物B液配制成*誘導(dǎo)培養(yǎng)基B，充分混勻。
• C：2-8℃過夜融化添加物C液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基A液的另一份45 ml，配制成*誘導(dǎo)培養(yǎng)基C，充分混勻。
• 添加物B液必須充分復(fù)溫，內(nèi)容物充分解凍為透明無沉淀?；旌铣烧T導(dǎo)*培養(yǎng)基后必須充分混勻，2-8 ℃保存。整個(gè)過程須確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。
• O染液（工作液）：取油紅O儲(chǔ)液，與蒸餾水以3：2的比例混合均勻，中性濾紙過濾，即配制成了油紅O染液（工作液）。
• 培養(yǎng)皿處理：
• D液到培養(yǎng)器皿中，輕輕搖動(dòng)使其覆蓋整個(gè)培養(yǎng)器皿底面，室溫靜置30-60分鐘。棄去溶液，室溫晾干。
• 包被液C使用前必須進(jìn)行室溫復(fù)溫。建議使用六孔板，每孔加D液1 ml，使用其他培養(yǎng)器皿時(shí)需考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。整個(gè)過程需在超凈工作臺(tái)中操作，避免污染。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • MSC*培養(yǎng)基
  • 4%中性多聚甲醛溶液
• 若MSC*培養(yǎng)基不含血清，則需要準(zhǔn)備胰酶抑制劑。MSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴(yán)格控制消化時(shí)間。

操作步驟

1. 準(zhǔn)備所需誘導(dǎo)分化的MSC，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)85%左右時(shí)，用消化液消化細(xì)胞，并用MSC*培養(yǎng)基重懸。
2. 按照3×10⁴ cells/cm²的密度將細(xì)胞接種于已包被處理的六孔板中，每孔MSC*培養(yǎng)基2 ml，37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3. 細(xì)胞密度為該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)密度，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整依據(jù)參照所檢測(cè)MSC正常傳代的密度的2倍接種，培養(yǎng)24小時(shí)后添加誘導(dǎo)培養(yǎng)*培養(yǎng)基；或接種密度低，待細(xì)胞生長(zhǎng)至下一步要求的密度后進(jìn)行誘導(dǎo)。
3. 當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，每孔添加誘導(dǎo)液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂培養(yǎng)。
4. 成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞易脫壁，換液時(shí)*培養(yǎng)基必須經(jīng)室溫復(fù)溫30分鐘。添加培養(yǎng)基時(shí)動(dòng)作要輕柔，沿培養(yǎng)器皿側(cè)壁緩緩加入，避免吹起細(xì)胞。細(xì)胞起始誘導(dǎo)融合度對(duì)誘導(dǎo)效果十分關(guān)鍵，必須確保細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠密時(shí)再進(jìn)行誘導(dǎo)。
4. 誘導(dǎo)培養(yǎng)72 小時(shí)后棄去原培養(yǎng)上清，添加誘導(dǎo)液C 2 ml/孔，37℃、5%CO₂繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 小時(shí)后棄去原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 重復(fù)步驟4、5約3-5次，待細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴時(shí)更換為誘導(dǎo)液C繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 注意：一般在培養(yǎng)4天左右高倍鏡下能看到細(xì)胞漿內(nèi)有較多數(shù)量的圓形亮泡，5-9天融合為較大的亮泡，這些結(jié)構(gòu)圍繞在細(xì)胞核周圍，較大的與細(xì)胞核大小相當(dāng)。狀態(tài)較好的細(xì)胞10天內(nèi)可結(jié)束培養(yǎng)過程，若10天后仍未見脂滴結(jié)構(gòu)，請(qǐng)注意分析操作步驟與其他原因。
8. 每2天更換新鮮誘導(dǎo)液C，繼續(xù)培養(yǎng)至脂滴足夠大時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。
9. 換液時(shí)誘導(dǎo)液必須經(jīng)過復(fù)溫，否則影響誘導(dǎo)效果和可能導(dǎo)致細(xì)胞脫壁。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)結(jié)束時(shí)間，若成脂面積過大或脂滴過大導(dǎo)致連成片則不利于結(jié)果的呈現(xiàn)，建議提前終止。不同實(shí)驗(yàn)室MSC誘導(dǎo)時(shí)出現(xiàn)脂滴的時(shí)間不盡相同，若大面積出現(xiàn)脂滴較早，則可提前更換為誘導(dǎo)液C。
9. 誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，DPBS洗細(xì)胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室溫固定細(xì)胞20分鐘。
10. 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)或中途可以選擇其他檢測(cè)方法，如基因表達(dá)檢測(cè)等，若采用自己的檢測(cè)方法則后續(xù)方案需要自己擬定。
10. 棄去固定液，DPBS洗2次，加入油紅O染液（工作液）1 ml/孔染色15分鐘。
11. 該步驟適用于鑒定成脂能力，若出現(xiàn)脂滴（脂肪細(xì)胞）則會(huì)呈現(xiàn)紅色著色。若需要得到美觀的圖片，則染色時(shí)間需自己掌握。
11. 棄去油紅O染液（工作液），DPBS洗3次。
12. 染色后肉眼可見孔內(nèi)明顯染紅。染色過程中一定要避免組織細(xì)胞被風(fēng)干，風(fēng)干會(huì)影響顯微觀察效果。
12. 顯微鏡下觀察并拍照。
13. 拍照一般選用高倍鏡，請(qǐng)根據(jù)需要確認(rèn)選擇。
13. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見大面積紅色著色點(diǎn)，20倍和40倍鏡下可觀察到紅色球形在細(xì)胞內(nèi)的情況，此紅色著色球?yàn)橹?，說明實(shí)驗(yàn)所用的MSC具有成脂能力。否則，所使用的MSC無成脂能力。
14. 該判定標(biāo)準(zhǔn)僅進(jìn)行定性分析，若需要進(jìn)行定量分析，需要自行制定方案。