人間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)試劑盒

僅用于科學(xué)研究

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：人間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)試劑盒

貨號：FY200006

批號：見包裝

存儲與有效期：

組分A、C、D于2-8 ℃避光保存，組分B于-20 ℃避光保存。所有組分均須避免反復(fù)凍融及復(fù)溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養(yǎng)基于2-8 ℃保存，有效期1個月。

適用細胞：

人骨髓間充質(zhì)干細胞、人脂肪間充質(zhì)干細胞、人臍帶間充質(zhì)干細胞、人羊膜間充質(zhì)干細胞、人牙髓間充質(zhì)干細胞、人臍帶血間充質(zhì)干細胞，其他組織來源的人間充質(zhì)干細胞。

產(chǎn)品介紹

間充質(zhì)干細胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞。2006年國ji細胞治療協(xié)會（ISCT）確定此三項檢測指標是MSC鑒定的必檢項目，目前以MSC為基礎(chǔ)的研究報道均會對該三個指標進行鑒定。在多種組織來源和制作方法的MSC藥品質(zhì)量控制中，成骨、成脂、成軟骨也是必檢指標。

為滿足科研和制藥對MSC分化能力的鑒定，弗元生物結(jié)合多年MSC研究經(jīng)驗優(yōu)化MSC誘導(dǎo)試劑盒，在穩(wěn)定性、易用性上大幅改進，采用了精心設(shè)計的小包裝。該試劑盒的設(shè)計用途，首先，用于鑒定人MSC是否具有成骨分化能力，滿足MSC質(zhì)量控制的要求。其次，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基也可作為除支架以外的培養(yǎng)培養(yǎng)體系。另外，誘導(dǎo)培養(yǎng)基還可用于研究誘導(dǎo)分化過程中的其他檢測，如mRNA檢測、lncRNA檢測、microRNA檢測、蛋白表達檢測、鈣沉積量檢測、免疫組化檢測等。

本產(chǎn)品僅適用于科學(xué)研究。

操作方法

實驗準備

• 試劑配制：
• B液，將融化的溶液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基A液中，充分混勻。
• 混合成誘導(dǎo)*培養(yǎng)基后必須充分混勻，2-8 ℃保存。整個過程須確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。
• 培養(yǎng)皿處理：
• C液到培養(yǎng)器皿中，輕輕搖動使其覆蓋整個培養(yǎng)器皿底面，室溫靜置30-60分鐘。棄去溶液 ，室溫晾干。
• 包被液C使用前必須進行室溫復(fù)溫。建議使用六孔板，每孔加C液1 ml，使用其他培養(yǎng)器皿時需考慮實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。整個過程需在超凈工作臺中操作，避免污染。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）
  • 磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • MSC*培養(yǎng)基
  • 4%中性多聚甲醛溶液
• 若MSC*培養(yǎng)基不含血清，則需要準備胰酶抑制劑。MSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴格控制消化時間。

操作步驟

1. 準備所需誘導(dǎo)分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，并用MSC*培養(yǎng)基重懸。
2. 按照2×10⁴ cells/cm²的密度將細胞接種于已包被處理的六孔板中，每孔MSC*培養(yǎng)基2 ml，37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3. 細胞密度為該試劑盒的標準密度，可根據(jù)實驗室情況進行調(diào)整，調(diào)整依據(jù)參照所檢測MSC正常傳代的密度接種，過夜培養(yǎng)后添加誘導(dǎo)培養(yǎng)*培養(yǎng)基；或接種密度低，待細胞生長至下一步要求的密度后進行誘導(dǎo)。
3. 當細胞融合達60%時，棄去培養(yǎng)上清，每孔添加MSC成骨誘導(dǎo)*培養(yǎng)基2 ml/孔，37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4. 成骨誘導(dǎo)后細胞易脫壁，換液時*培養(yǎng)基必須經(jīng)室溫復(fù)溫30分鐘。添加培養(yǎng)基時動作要輕柔，沿培養(yǎng)器皿側(cè)壁緩緩加入，切記避免吹起細胞。
4. 每3天更換新鮮的MSC成骨誘導(dǎo)*培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2-4周。
5. 細胞狀態(tài)良好一般5天后培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，不可與污染混淆，換液時盡量輕柔；7-10天左右出現(xiàn)鈣沉積。一般2周內(nèi)出現(xiàn)較大的較厚的鈣沉積，透光性變差。有些細胞鈣沉積出現(xiàn)較晚，一般不超過3周，超過3周未出現(xiàn)明顯沉積，請注意分析操作步驟與其他原因。可根據(jù)具體實驗需求選擇終止時間，但不易超過4周。具體時間請根據(jù)自己實驗室細胞等條件自行確定。
5. 誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束時，棄去培養(yǎng)上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室溫固定細胞20分鐘。
6. 培養(yǎng)結(jié)束時或中途可以選擇其他檢測方法，如基因表達檢測等，若采用自己擬定的檢測方法則后續(xù)方案需要自行確定。
6. 棄去固定液，DPBS洗2次，加入茜素紅染液1 ml/孔染色15分鐘。
7. 棄去茜素紅染液，DPBS洗3次，添加新鮮DPBS。
8. 染色后肉眼可見孔內(nèi)明顯染紅。染色過程中一定要避免組織細胞被風(fēng)干，風(fēng)干會影響顯微觀察效果。
8. 顯微鏡下觀察并拍照。
9. 拍照一般選用高倍鏡，請根據(jù)需要確認選擇。
9. 結(jié)果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見紅色著色點，此處為鈣結(jié)節(jié)，說明實驗所用的MSC具有成骨能力。否則，所使用的MSC無成骨能力。