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上海源葉生物科技有限公司
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電穿孔法進(jìn)行質(zhì)體的轉(zhuǎn)形2010/11/25
儀器用具：37℃培養(yǎng)箱及冰浴Electroporationcuvette（electrodegap,0.1cm）Electroporator（Bio-Rad,IBIgeneZapper或其它廠牌）藥品試劑：無菌水（置冰浴中）10%glycerol（置冰浴中）SOB液體培養(yǎng)基SOB固體培養(yǎng)基SOC液體培養(yǎng)基SOC/Amp固體培養(yǎng)基大腸桿菌JM109Ligationmixtures方法步驟：菌體的處理：1）進(jìn)行轉(zhuǎn)形實(shí)驗(yàn)的前16~20h，將菌種JM109接種在SOB固體培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
標(biāo)記蛋白的概述2010/11/24
從建立了克隆表達(dá)技術(shù)以來，將2個(gè)編碼區(qū)域融合構(gòu)建一個(gè)具有2個(gè)起始多肽特性的新蛋白，已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。下圖利用來源于c-myc蛋白表位結(jié)構(gòu)的詳細(xì)知識，構(gòu)建了一個(gè)可供商品化抗體識別的新蛋白。這種方法已經(jīng)成為分子克隆的主要技術(shù)，任何新識別的編碼區(qū)均可通過在多肽上加一個(gè)表位序列，即可被特異性抗體識別。亦可將其他感興趣的蛋白或功能區(qū)的編碼基因與研究中的抗原基因融合，如將所研究的蛋白質(zhì)編碼基因與谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶（GST）基因融合，并可在E．coli中合成一個(gè)可溶性蛋白，該蛋白可通過與谷胱甘肽珠結(jié)合
免疫親和純化的操作步驟2010/11/24
1．主要內(nèi)容純化率為1000～10000倍?？焖偌兓乖瑢游鲋？芍貜?fù)使用。可獲得純化的抗原。不能用于定量測定。純化效果取決于抗原的濃度和抗體的親和力需要適當(dāng)純化的抗體。2．操作步驟（1）將抗體結(jié)合到蛋白A或蛋白G微珠上。對于一般用途的層析柱，每毫升濕的微珠大約可以結(jié)合2mg單克隆抗體或親和純化的多克隆抗體。將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的勻漿，在總量為10ml的溶液中加入大約lml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。（2）用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉（pH9．0）洗滌微珠2次，
親和純化抗體的制備2010/11/24
將純化的抗原與微珠共價(jià)結(jié)合，免疫親和純化技術(shù)可以用于分離抗特定抗原的特異性抗體。這種方法通常使用多克隆抗體，因其對相應(yīng)抗原和污染的抗原具有多種活性。識別多種抗原的問題會使很多免疫化學(xué)技術(shù)發(fā)生混淆。這一問題可以對抗原特異抗體進(jìn)行純化而得到解決。另一種用于抗體免疫親和純化的方法是濃縮特異性抗體，此法常用于抗多肽抗體的制備。這些抗體僅偶爾用于親和純化后。純化抗體的方法學(xué)和理論與上述步驟相同，將抗原與微珠共價(jià)偶聯(lián)，然后和抗體結(jié)合，再進(jìn)行洗脫。
FLAG標(biāo)記物2010/11/24
序列AspTyrLysAspAspAspAspLys（DYKDDDDK）抗體鼠源單抗MI和M2供應(yīng)商Sigma-Aldrich，其他供應(yīng)商商品化試劑在E．coli和酵母表達(dá)系統(tǒng)的氨基末端和羧基末端標(biāo)記載體純化和標(biāo)記的抗體以及親和樹脂純化多肽非商品化試劑在E．eoli，酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的多種載體FLAG標(biāo)記物是惟一專為標(biāo)記目的設(shè)計(jì)的多肽標(biāo)記物（Hoppetal．1988），其特點(diǎn)是標(biāo)記物的序列不是來自任何已知的蛋白。該標(biāo)記物是由8個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，具有親水性，可置于蛋白
用于純化的肽標(biāo)記物2010/11/24
zui近通過噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)得到了另外一種適合于進(jìn)行蛋白純化的多肽標(biāo)記物。多肽AWRHPQFGG可與鏈霉親和素結(jié)合。鏈霉親和素標(biāo)記物系統(tǒng)（Schmidtetal．1996）不受保護(hù)的影響，而且短的鏈霉親和素標(biāo)記物多肽序列可以標(biāo)準(zhǔn)的方法引入到感興趣的開放閱讀框中。鏈霉親和素柱可從商業(yè)渠道獲得。通過X射線晶體衍射技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天然配體生物素和鏈霉標(biāo)記物多肽在鏈霉親和素的同一區(qū)域與之發(fā)生結(jié)合，且被鏈霉親和素標(biāo)記的蛋白可通過二氨基生物素進(jìn)行洗脫。純化的肽標(biāo)記物純化標(biāo)記物純化配體標(biāo)記物來源序列說明文獻(xiàn)鏈霉標(biāo)記
采用PCR技術(shù)插人表位標(biāo)記物2010/11/24
許多表達(dá)載體可能沒有能夠克隆標(biāo)記物的合適的限制性酶切位點(diǎn)。在這種情況下，采用PCR技術(shù)將多肽標(biāo)記物插入到已經(jīng)克隆化的開放閱讀框。在設(shè)計(jì)PCR正向和反向引物時(shí)，可引入較長的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽標(biāo)記物。，選擇用于編碼標(biāo)記物特定氨基酸的密碼子，使其能夠用于表達(dá)標(biāo)記蛋白的生物系統(tǒng)中。引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)加入新的限制性酶切位點(diǎn)，以便PCR產(chǎn)物的克隆。應(yīng)在引物限制性部位5，端添加額外的堿基，這些“增添”的堿基有利于限制酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的切割。同時(shí)需注意保持正確的閱讀框和根據(jù)需求設(shè)計(jì)起始密碼和終
表位作圖方法的選擇2010/11/24
目前已有許多可供選用的蛋白質(zhì)抗原表位作圖方法，如用于研究抗原抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，或分析龐大的隨機(jī)肽鏈序列庫等。競爭分析法、基因表達(dá)分析法和合成肽鏈分析法等是應(yīng)用以及技術(shù)zui成熟的方法。推薦使用表位作圖方法和基本條件方法構(gòu)象表位線性表位條件度競爭分析法是是標(biāo)記抗體，抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達(dá)法是，但并非經(jīng)常是必須克隆，DNA（已知基因序列）構(gòu)象50--200個(gè)氨基酸線狀10--20個(gè)氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫*繪制3—15通過競爭分析法進(jìn)行表位作圖是應(yīng)用非常廣泛的一種方法，該法能夠
競爭分析作圖法實(shí)驗(yàn)原理2010/11/24
確定2種單克隆抗體是否結(jié)合蛋白質(zhì)抗原上同一位點(diǎn)的zui簡便的方法是競爭分析法。該方法可確定一種抗體是否對另一種抗體與某一位點(diǎn)的結(jié)合具有抑制作用。如果兩者相互競爭，說明2種抗體識別相同位點(diǎn)或同一蛋白質(zhì)的空間折疊結(jié)構(gòu)域。相反，如果2種抗體與抗原結(jié)合無相互競爭抑制作用，能夠同時(shí)與抗原結(jié)合，說明2種抗體具有不同的特異性，所識別的抗原表位也不同）。競爭試驗(yàn)競爭分析法對單克隆抗體的特異性分析zui為有用，而多克隆抗血清可識別多種不同的位點(diǎn)，故不宜用此法分析。檢測抗原與抗體間相互競爭結(jié)合試驗(yàn)的方法較多，但其中
競爭分析作圖法操作方法2010/11/24
1．試劑和溶液PBS；PBSTween（0．05％）；PBSPBA（PBS加1％BSA），不加疊氮鈉；0．1mol／L碳酸氫鈉緩沖液，pH9．6；鏈霉親和素—過氧化物酶結(jié)合物；兔抗鼠IgG-過氧化物酶結(jié)合物；YFPl；生物素標(biāo)記ZO-1抗體；末標(biāo)記的ZO-1抗體；未標(biāo)記的XHl和XH2抗體；未標(biāo)記的對照單抗PCI0；TMB底物（50mi50g／L儲存液，5ml0．1mol幾醋酸鈉pH6．6，lmlH202）。2．試驗(yàn)抗體和對照抗體的活性和滴度測定（1）YFPl儲藏液的制備：用0．1mol／L（p
基因片段表達(dá)作圖法2010/11/24
已有許多方法，包括已商品化的試劑盒（Novatope），被用來在一個(gè)表達(dá)載體系統(tǒng)中進(jìn)行隨機(jī)的或特定的開放閱讀框基因片段的表達(dá)。然后測定基因片段庫與特定抗體的反應(yīng)性，并進(jìn)行作圖。與抗體結(jié)合的基因片段序列特性，可以通過測序分析證實(shí)。在許多實(shí)驗(yàn)中，研究者可事先將所研究的基因片段庫克隆在表達(dá)載體中。其中的基因片段可能是不完整的cDNA片段，所有這些片段均可以通過簡單的免疫化學(xué)方法鑒定其中是否存在有相關(guān)的抗原表位。如果抗體與目的抗原在免疫印跡中具有較強(qiáng)的反應(yīng)，說明可采用同樣的方法分析任一表達(dá)的基因片段。如
合成肽表位作圖法2010/11/24
在這種方法中，需合成一系列末端相互重疊的肽鏈，每段都對應(yīng)于蛋白抗原線狀序列中的一小段，并將它們排列于固相上。用檢測抗體識別這些固相肽鏈，與之結(jié)合的特異性抗體，采用酶標(biāo)記的二抗檢測。這種方法快速、成功率高。如果使用的抗體在免疫印跡反應(yīng)中效果較好，此法所得結(jié)果清晰，并能識別那些耐變性的蛋白表位。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中并非所有的抗體均能很好的反應(yīng)，抗體僅對那些具有耐變性特性的蛋白質(zhì)反應(yīng)較好。系列肽鏈的設(shè)計(jì)如果時(shí)間和經(jīng)費(fèi)都允許，合適的肽鏈應(yīng)該zui大可能地覆蓋所要作圖的表位（每段肽鏈15～20個(gè)氨基酸），而且每段
系列肽的合成或購買2010/11/24
許多商業(yè)性公司可以提供合成肽，或商業(yè)化的試劑盒，或用于實(shí)驗(yàn)室的合成儀。但都價(jià)格昂貴。肽鏈的合成可以采用特制的聚乙烯大頭針作支持體的超微量固相多肽合成技術(shù)，在塑料微量滴定盒或在紙上進(jìn)行。系列肽可以直接在固相支持物上用抗體檢測，或者從固相支持物上切割下來再進(jìn)行分析。如果需要的只是對1～2種抗體識別的表位作圖，回答“是”或“不是”，那么該系統(tǒng)就已足夠，而且十分經(jīng)濟(jì)。如果待測抗原是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的大項(xiàng)目，建議購買那種具有游離生物素結(jié)合的、在生物素和同源肽序列間有4個(gè)氨基酸間隙的肽。購買此種肽鏈一般是lmg
生物素標(biāo)記肽的檢測方法2010/11/24
1．準(zhǔn)備工作該檢測是在96孔微板上進(jìn)行，每孔均先用鏈霉親合素包被，分別依次加入待進(jìn)行表位作圖的肽系列，并用需定位的抗體檢測。2．試劑和溶液0．1％PBS-Tween；2％BsA／PBS；0．1％（wt／v01）BSA／PBS；肽；過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體；TMB底物（取50／xl50g／LTMB儲存液，加入5ml0．1m01醋酸鈉，pH6．6，另加1ul過氧化氫）；100btmol硫酸。3．操作步驟（1）干肽溶于100％DMSO中，使其貯存液的濃度為10mg／m1，工作液的終濃度為lmg／ml，
表位作圖2010/11/24
早期表位作圖或定位（epitopemapping）主要是采用精細(xì)的、但十分繁瑣的蛋白質(zhì)化學(xué)方法。這些方法是基于蛋白質(zhì)修飾和降解的原理，可經(jīng)側(cè)鏈化學(xué)修飾法選擇性地標(biāo)記氨基酸，失去結(jié)合的部分將被測出。蛋白質(zhì)抗原被降解為小片段，經(jīng)測序后確定抗體結(jié)合的位點(diǎn)。雖然其結(jié)果在蛋白化學(xué)中是非常的例子，但是要確定某一抗原的全部表位需要大量的時(shí)間。分子克隆技術(shù)和肽鏈合成方法的進(jìn)展極大地促進(jìn)了表位作圖方法的改進(jìn)?，F(xiàn)已可以通過誘變、蛋白質(zhì)合成或蛋白競爭結(jié)合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應(yīng)用對抗體結(jié)合表位的分析具有
透析袋的準(zhǔn)備2010/11/24
有些透析袋不需要處理，根據(jù)供應(yīng)商品的說明決定是否進(jìn)行處理。1．剪取適當(dāng)長度的透析袋。通常長度為10cm、20cm和30cm。2．將透析袋放入大體積的5mm01／LEDTA，200mm01／lN9HC03溶液中。3．煮沸5min。傾棄EDTA／NaHC03液，用去離子水輕輕漂洗。再加大量的5mm01／LEDTA，200mmol／L溶液并煮沸5min。在上述步驟中，應(yīng)注意透析袋一定要浸泡于溶液中。4．棄去第二次洗液，*用去離子水清洗；然后，加入大量的去離子水漂洗并蓋好（是用鋁箔）。5．高壓滅菌10m
氣相色譜法測定氯霉素CAP殘留2010/11/13
（1）試劑和材料除另有規(guī)定外所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或相當(dāng)?shù)娜ルx子水。①乙酸乙酯：重蒸餾②甲醇：重蒸餾③正己烷：重蒸餾④丙酮：重蒸餾⑤硅烷化試劑：3ml六甲基⑥氯化鈉水溶液：1mol／L⑦氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥99．5％⑧氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)晶，用丙酮配成o．10rug／mi的貯備液，根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。（2）儀器和設(shè)備①氣相色譜儀：配有電子俘獲檢測器②均質(zhì)器③離心機(jī)：3000r／mtn④多功能微量化學(xué)樣品處理儀或其他相當(dāng)?shù)膬x器⑤具塞離心管：5ml⑥離心管
液相色譜法測定氯霉素CAP殘留2010/11/13
（1）試劑和材料除另有規(guī)定外所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或相當(dāng)?shù)娜ルx子水。①乙酸乙酯：分析純②甲醇：紫外光譜級⑧正己烷：分析純④高氯酸：分析純，o．5mol幾⑤氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥99％⑥氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)晶，用甲醇配成o．10mg／m1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，根據(jù)需要吸取適量貯備液，將甲醇吹去后用o．5mol／L高氯酸溶液配制成癥當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。（2）儀器和設(shè)備①液相色譜儀：配有紫外線檢測器②均質(zhì)器：10000r／mln③離心機(jī)：3000r／Hill）．④微量注射器：25,~
氣/質(zhì)聯(lián)用法測定氯霉素CAP殘留2010/11/09
（1）試劑和材料以下所用的試劑，特別注明外均為分析純試劑；水為符合GB／T6682規(guī)定的二級水。①氯霉素：含氯霉素不得少于99．o％②丙酮：色譜純③甲醇：色譜純④乙酸乙酯：分析純⑤正己烷：分析純⑥4％氯化鈉溶液：稱取適量的氯化鈉，配制成濃度為4％的氯化鈉溶液⑦硅烷化試劑：BSTFA+TMCS，99；l，lml／瓶⑧氯霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取氯霉素約50mg，105~（2干燥4h，精密稱量，置于50ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為lmg／ml的貯備液，置4℃冰箱中密封保存，
飼料中的動物源性成分鑒別技術(shù)2010/11/09
自1987年英國首先發(fā)生瘋牛病以來，隨后*許多國家都相繼發(fā)現(xiàn)了瘋牛病，大量的證據(jù)表明：飼喂被朊蛋白（prion）污染的反芻動物源性蛋白是瘋牛病傳播的主要途徑，為此世界上許多國家和地區(qū)都先后頒布了法律，法規(guī)以控制動物源性成分的使用。1994年歐盟和1997年美國都制定了法規(guī)禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白，1996年世界衛(wèi)生組織建議所有的國家禁止在反芻動物的飼料牛添加反芻動物源性蛋白，2000年歐盟將這項(xiàng)禁令擴(kuò)大到禁止向用于食用的動物飼喂加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國新頒布的
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