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上海源葉生物科技有限公司
初級(jí)會(huì)員 | 第16年
水泡性口炎病原學(xué)2011/01/04
水泡性口炎是由水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV）引起的馬、牛、豬等動(dòng)物的水皰性疾病，患畜在舌面、牙齦、口唇等口腔黏膜，以及蹄部、乳頭周圍等部位出現(xiàn)水皰和破潰，臨床上與口蹄疫（FMD）、豬水泡病（SVD）難以區(qū)別。人感染后出現(xiàn)類似流感癥狀，也可引起嚴(yán)重的腦炎。該病主要發(fā)生于美洲國家，歐洲及非洲的一些地區(qū)有過報(bào)道，亞洲的印度和伊朗也曾有發(fā)生。OIE將其列為A類動(dòng)物疫病，是動(dòng)物及畜產(chǎn)品貿(mào)易中的重要檢疫對(duì)象。1927年分離到病原，但該病zui早可追溯至19世紀(jì)初，
用抗人抗體包被微珠2011/01/04
[器材和試劑]●磁珠（DynabeadsM-450，甲苯磺?；罨?，Dynal）●硼酸鹽緩沖液（50mmol/L硼酸鈉，pH9．5）每抗人Fc多克隆抗體（免疫純的羊抗人IgGFc片段特異性抗體，Pierce）●磁分離器（Dynal）●PBS（磷酸鹽緩沖液：2mmol/LNaH2PO4H20，16mmol/LNa2HPO4·2H20，15mmol/LNaCl）●PBBS（PBS，0．1％BSA）●硫柳汞（Sigma）[方法]1．將500ul已充分混懸的磁珠轉(zhuǎn)移到1支Eppendorf管中。將該管置于
擴(kuò)增來自淘洗的噬菌體群落2011/01/04
[器材和試劑]●噬菌體緩沖液●XLl-Blue或者DH5。F，TB細(xì)胞●IPTG（30mg/m1儲(chǔ)存液，水溶液；儲(chǔ)存在-20℃）●LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG●Luria-Bertani（LB）[L-液體培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0，5％酵母提取物，0．085m01/LNaCl，pH7．2）]●LB+Amp（L-液體培養(yǎng)基，50ug/m1Amp）●X-gal（30mg/m1儲(chǔ)存液，溶于N，N-二甲基甲酰胺中；暗處儲(chǔ)存在一20℃）●LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu[L-瓊脂培養(yǎng)
利用血清篩選噬菌體文庫的篩選2011/01/04
[器材和試劑]●PBBST（PBS，0．1％BSA，0．1％Tween-20）●磁分離儀（Dynal）●f1Rl紫外滅活噬菌體●洗脫緩沖液（用甘氨酸將0．1mol/LHCl調(diào)整到pH2．2，1mg/mlBSA）●2rn01/LTris-HClpH9．0●LB-瓊脂培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0．5％酵母提取物，1．5％細(xì)菌用瓊脂，0．17Trl01/LNaCl，pH7．2）●LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG[LB-瓊脂培養(yǎng)基，50/xg/m1青霉素，35ug/mlX-gal（5-溴
UV滅活載體噬菌體的制備2011/01/04
[器材和試劑]●XL1-B1ue或者DHF’TB細(xì)胞●f1R1噬菌體●TB●TBS（tris緩沖鹽水；50mmol/LTris-HCLpH7．6,150mmol/LNaCl，0．05％硫柳汞）●PEG/NaCl溶液（20％PEG，2，5mol/LNaCl）●皮氏培養(yǎng)皿，直徑150mm（Falcon）●UVStratalinker2400（Stratagene）●硫柳汞（Sigma）[方法]1．用來自備存材料的或直接取自一個(gè)噬菌斑的f1Rl噬菌體，其濃度大約為109個(gè)噬菌斑形成單位（pfu），感染
甲醛洋菜2011/01/04
甲醛洋菜膠體電泳（formaldehyde-agarosegelelectrophoresis）甲醛是一種常用的RNA變性劑。在進(jìn)行甲醛洋菜膠體電泳分析時(shí)，必須先配制含有甲醛的洋菜膠體，RNA也必須先以甲醛及formamide進(jìn)行變性處理，以確保其二度結(jié)構(gòu)充分被打開。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì)，配制膠體及進(jìn)行電泳分析時(shí)都應(yīng)在抽氣櫥里小心操作；進(jìn)行電泳時(shí)所使用的緩沖液為MOPS（3-[N-morpholino]propanesulfonicacid）。此外，含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜，容易破裂，在
蛋白質(zhì)純化離子交換法2011/01/04
各種蛋白質(zhì)分子上可能帶有不同的電性，經(jīng)過離子交換管柱，可依其分子帶電性的差異而分離開來（Pharmacia操作手冊(cè),IonExchange）。儀器設(shè)備：塑料管柱（Bio-RadEcono-Paccolumn732-1010,1.5×12cm）分劃收集器（fractioncollector,另需準(zhǔn)備干凈試管約60支）濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）及濃縮離心管Centriplus藥品試劑：DEAESephacel（膠體體積約15mL，預(yù)先以緩沖液BufferA-0平衡好）BufferA-0（如
抗原修復(fù)存在的問題和克服的方法2010/12/30
高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，對(duì)某些存在的問題不可能用設(shè)計(jì)對(duì)照的方法加以解決。有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好地顯示。對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)過修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)，例如p185、Bcl—2、P-gp和nm23；而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過修復(fù)會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如p53、PCNA、ki-67和細(xì)胞周期素等。因此在使用該方法時(shí)一定小心，對(duì)結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析。某些商品化抗體因自身抗體質(zhì)量的問題，在石蠟切片上無論用什么方法，抗原怎么修復(fù)都無法顯示陽
離子交換法分離與純化蛋白質(zhì)2010/12/30
蛋白質(zhì)和酶都具有電解質(zhì)性質(zhì)，故可用離子交換劑進(jìn)行分離提純，特別是經(jīng)過了初步純化后的蛋白質(zhì)和酶采用此法效果尤為顯著。有關(guān)離子交換劑及其使用技術(shù)，參閱有關(guān)專著，這里介紹近年來以纖維素衍生物作為離子交換劑純化蛋白質(zhì)及酶的方法。在這類衍生物中以二乙氨基乙基纖維素（簡稱DEAE-纖維素，為陰離子交換劑）及甲基纖維素（簡稱CM-纖維素，為陽離子交換劑）應(yīng)用zui廣泛。DEAE-纖維素是纖維素結(jié)構(gòu)中的氫原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱堿性化合物，它作為陰離子交換劑的原理是：在實(shí)際工作中常用磷酸緩沖液平衡
熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)（AR）的應(yīng)用范圍2010/12/30
AR技術(shù)的引入，使IHC的極大部分多克隆和單克隆抗體不僅能用于冰凍切片的檢測(cè)，而且能用于存檔石蠟切片的檢測(cè)，再加上敏感或增敏方法的應(yīng)用，使原來全部陰性的抗原其陽性檢測(cè)率得到質(zhì)的飛躍，例如ki-67、ER、PR、細(xì)胞周期和許多CD類抗原。目前已將該技術(shù)應(yīng)用到Tunel、ISH和FISH的檢測(cè)，以及樹脂包埋的半薄和超薄切片的IHC檢測(cè)，并三用到非交聯(lián)劑固定的活細(xì)胞和細(xì)胞涂片中抗原的檢測(cè)，以及從甲醛固定的石蠟包埋組織中提取DAN／RNA等領(lǐng)域。Lan等（2000）還將該技術(shù)應(yīng)用到IHC的雙重標(biāo)記，認(rèn)為
DNA合成儀的使用方法2010/12/30
亞磷酰胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷酰胺DNA合成的試劑有：保護(hù)堿基的5／—DMT，A、G、C、T亞磷酰胺單體，四唑偶聯(lián)催化劑，乙酐，N—甲基咪唑封閉試劑，三氯乙酸（TCA）脫保護(hù)溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶劑，氨水切除溶液。使用步驟如下：1）仔細(xì)檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量，必要時(shí)換掉試劑瓶，特別注意乙腈的量，因?yàn)樵撊軇┯昧枯^大。2）將標(biāo)記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。3）將要合成的DNA序列輸入合成儀。4）檢查選擇的合成步驟是否正確。5）選擇結(jié)束方法：Trityl
火箭免疫電泳法測(cè)定人血漿中補(bǔ)體C5含量2010/12/30
1．主要試劑（1）抗人C5抗體：一般工作稀釋度為1：40。（2）電泳緩沖液：pH8．6含0．01mol／LEDTA的0．02mol／L巴比妥鈉—HCl緩沖液。（3）待檢樣本：EDTA抗凝血漿，加樣時(shí)1：4稀釋。2．操作同C4、Bf測(cè)定?；鸺庖唠娪痉ㄒ部捎脕頇z測(cè)C4、C5的活化程度，C4活化后可在含抗C4瓊脂糖凝膠板上形成內(nèi)外2個(gè)沉淀峰，外峰為C4d、內(nèi)峰為C4和C4c。C5活化后可在含抗C5瓊脂糖凝膠板上形成外峰（C5b）、內(nèi)峰（C5、C）。以外峰／內(nèi)峰比值的大小反映補(bǔ)體的活化程度，比值大于1
蛋白質(zhì)純化膠體過濾法2010/12/30
儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；分劃收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請(qǐng)注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA-150平衡好，并且使*沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫
以毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行北方轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)2010/12/30
要進(jìn)行北方雜合反應(yīng)前，必須先將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙（nitrocellulosemembrane）或尼龍膜（nylonmembrane）上，這一個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)?。╞lotting）。一般常用的方法包括毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（capillarytransfer）、真空轉(zhuǎn)移法（vacuumtransfer）與電轉(zhuǎn)印法（electroblotting）。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)所產(chǎn)生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印*，起碼需要作用6h以上。雖然所需花費(fèi)的時(shí)間比較長，以其不須
PCR參數(shù)設(shè)定的基本原則2010/12/23
一個(gè)PCR反應(yīng)開始，首先是雙鏈DNA解離為單鏈，使之有利于與引物結(jié)合過程可以通過加熱來完成。在90—95℃條件下，即使復(fù)雜的DNA分子，如人基因組DNA也可變性成單鏈，根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94‘C、30s可使各種復(fù)雜DNA分子*變性。過高溫度或持續(xù)時(shí)間過長，對(duì)TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都會(huì)造成損害。變性后的DNA很快冷卻至40～60℃，即可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合。這是由于模板DNA結(jié)構(gòu)比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間碰撞的機(jī)會(huì)大大高于模板互補(bǔ)
有機(jī)溶劑沉淀法分離與純化蛋白質(zhì)2010/12/23
有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機(jī)溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質(zhì)或酶的提純。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作必須在低溫下進(jìn)行，并在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降，分離后的蛋白質(zhì)沉淀，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度。操作時(shí)的pH
蛋白質(zhì)和酶的提取方法2010/12/23
蛋白質(zhì)是由許多氨基酸連接而成的高分子物質(zhì)，分子量從數(shù)千至百萬。數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)，按它們的功能可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、運(yùn)輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如膠原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的差異，它們?nèi)芙舛纫哺鞑幌嗤?。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于有機(jī)溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對(duì)選擇撮蛋白質(zhì)的溶劑具有重要意義。（1）水溶液提?。河捎诘鞍踪|(zhì)大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質(zhì)以水溶
單克隆抗體細(xì)胞的選擇2010/12/23
（一）脾細(xì)胞1．材料（1）免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。（2）1640培養(yǎng)液（3）2.5％FCS－1640營養(yǎng)液2．操作方法（1）拉頸或用CO2處死小白鼠。（2）將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。（3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。（4）用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。（5）直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。（6）以2.5％FCS—1640充滿離心
α2巨球蛋白（α2M） 的測(cè)定2010/12/23
α2巨球蛋白（α2-macroslobulin，α2M）是血清中有重要生物學(xué)活性的大分子糖蛋白，分子量725kD。主要由肝臟合成，骨骼肌也能合成，半壽期約10d。α2M是一種廣譜蛋白酶抑制劑，可與多種肽鏈內(nèi)切酶形成不可逆性復(fù)合物，是纖溶酶的主要抑制物，在維持出、凝血平衡上具有重要作用。它除具有抗放射損傷作用外，尚可參與免疫調(diào)控。業(yè)已證實(shí)，α2M在體內(nèi)外能抑制多種免疫反應(yīng)，與慢性肝、腎疾病的關(guān)系較為密切。因?yàn)檠逯笑?M含量較高，故用單向免疫擴(kuò)散法、火箭電泳法、速率散射濁度法等即可檢測(cè)。在純化α2
甲醛洋菜膠體2010/12/23
甲醛洋菜膠體電泳（formaldehyde-agarosegelelectrophoresis）甲醛是一種常用的RNA變性劑。在進(jìn)行甲醛洋菜膠體電泳分析時(shí)，必須先配制含有甲醛的洋菜膠體，RNA也必須先以甲醛及formamide進(jìn)行變性處理，以確保其二度結(jié)構(gòu)充分被打開。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì)，配制膠體及進(jìn)行電泳分析時(shí)都應(yīng)在抽氣櫥里小心操作；進(jìn)行電泳時(shí)所使用的緩沖液為MOPS（3-[N-morpholino]propanesulfonicacid）。此外，含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜，容易破裂，在
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